一文搞懂TCGA中的分析结果如何来

TCGA对于不同类型的数据，有着独特的处理流程，具体如下

1. DNA-Seq Analysis Pipeline

TCGA中的DNA测序主要用来分析肿瘤患者中的体细胞突变，和GATK的体细胞突变流程类似，前期都经过了一个预处理步骤，这里称之为co-cleanning, 流程示意如下

就是经典的sort->markduplicate->Realign->BQSR步骤，得到co-cleaned BAM文件。然后用配对的肿瘤和正常样本进行somatic variant calling, 得到VCF文件。然后进行体细胞突变的注释，得到突变注释文件MAF, 示意如下

在进行体细胞突变位点分析时，使用了以下4款不同的软件同时分析

1. MuSE
2. Mutect2
3. SomaticSniper
4. Varscan2

各自对应的pipeline示意如下

各自pipeline得到的VCF文件，使用VEP软件对体细胞突变位点进行注释，使用了以下数据库进行注释

1. GENCODE v.22
2. sift v.5.2.2
3. ESP v.20141103
4. polyphen v.2.2.2
5. dbSNP v.146
6. Ensembl genebuild v.2014-07
7. Ensembl regbuild v.13.0
8. HGMD public v.20154
9. ClinVar v.201601

注释完成之后，会对突变位点进行过滤，去除低质量的突变位点和潜在的生殖细胞突变位点，剩余的位点作为最终的体细胞突变位点，保存在MAF文件中供下载。

当然对于没有配对的正常样本，也有tumor-only variant calling workflow来处理，具体请参考以下链接

https://docs.gdc.cancer.gov/Data/Bioinformatics_Pipelines/DNA_Seq_Variant_Calling_Pipeline

2. mRNA Analysis Pipeline

mRNA分析是通过STAR的2-pass模式比对hg38参考基因组，然后使用HTSeq进行定量，定量时基于Gencode V22版本的GTF文件，流程示意如下

在定量时，提供了以下3种策略

1. Raw count
2. FPKM
3. FPKM-UQ

Raw count和FPKM是转录组分析中经典的定量策略，而FPKM-UQ则是在FPKM基础上新提出的一种策略，计算公式如下

和FPKM不同的是，在FPKM-UQ中采用所有基因Mapping reads数目的上四分位数代替了所有基因Mapping Reads的总数。官方也提供了一个示例帮助我们理解具体的计算过程

3. miRNA Analysis Pipeline

miRNA的分析采用了BCGSC开发的miRNA定量流程，这套流程只针对已知的miRNA进行定量，链接如下

https://github.com/bcgsc/mirna

流程示意如下

4. Copy Number Variation Analysis Pipeline

使用Affymetrix SNP 6.0芯片来分析CNV, 首先使用DNACopy这个R包来计算拷贝数，然后用GISTIC2根据CNV来评估基因的变化情况，是loss还是gain, 流程示意如下

5. Methylation Liftover Pipeline

通过illumina Infinum Human Methylation 27和HumanMethylation450 两个芯片平台来分析DNA甲基化，采用了beta值的定量策略。同时考虑到这两个探针是针对hg19来设计的，将探针序列与hg38进行比对，当MAPQ<10或者I型和II型探针比对到不同基因组区域时，过滤到这部分探针。剩余的CpG文件根据GENCODE V22版本的GTF来进行注释，根据这样的策略将hg19上的甲基化移植到hg38版本的基因组上，具体流程示意如下

了解TCGA数据分析的流程，可以更好的在GDC数据库中筛选数据，也可以更好的和自己的数据进行比较。