如何降低荧光实验的自发荧光？

免疫荧光染色实验最烦恼的就是自发荧光，如何降低这种影响呢？

小编这里有几条建议，可供参考。

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前言

为什么SCI看起来高大上呢？

小编的经验是：观点创新+排版漂亮+图片绚烂+语言精练。

所谓一图胜千言，前提是图的质量一定要高。

现在越来越多人会在文章中加入免疫荧光图片，简化语言描述的同时也能有效提高文章档次。

免疫荧光染色图片非常绚烂，其实验步骤并不复杂。仅仅是将普通二抗换成荧光标记的二抗，避光操作，DAPI染核，最后采用荧光显微镜在不同波段激发下采集图片，其它步骤几乎与传统的IHC步骤一致。

但是接触过的人都明白，免疫荧光标记存在一个很大的问题，即自发荧光。这将极大地降低实验图片的可用性和美观性。

自发荧光类似于传统IHC的背景性染色。如下图中的大片绿色荧光，几乎都是自发性荧光。

自发荧光的解决办法有两种，采用冰冻切片染色或降低石蜡切片染色的自发荧光。

今日主要是探讨如何降低免疫荧光染色实验中的石蜡切片自发性荧光，且听小编慢慢道来。

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石蜡切片的特点

2.1 石蜡切片可以薄至3μm，实验过程中组织损耗较少。

采用大鼠、新西兰兔、beagle犬、食蟹猴、小型猪等相对较大的动物进行实验时，我们几乎不用担心组织损耗问题。

但是，而采用普通小鼠、基因敲除小鼠等小动物进行实验时，我们经常需要对同一组织进行病理、分子生物学研究，冰冻切片会极大消耗组织用量，而石蜡切片可能是一个更折中的选择。

2.2 石蜡切片可以较好地保存抗原的空间结构

免疫学实验最初的目的并不是为了定量研究，而是为了观察抗原在组织中的空间定位。石蜡切片组织结构的空间位置保存较好，几乎是原位保存。

虽然冰冻切片几乎看不到太多的自发荧光，但是它也存在一个问题，即如果制片效果较差，冰晶的形成或者融化会使得抗原位置会发生较大偏移。对于需要精确定位的研究目标或者荧光多标记Merge来讲，这一点不得不引起重视。

2.3 石蜡切片的缺点是自发荧光太强

自发荧光是指组织未经过荧光色素染色时，在激发光下自发呈现的荧光。

据广大同行的经验，石蜡切片的自发性荧光是影响实验结果的主要因素(原因不明)，其分布是均匀弥散的、布满整张切片的。在汞灯瓦数较大时，这一现象尤为明显。紫外和紫光区域激发的有色氨酸类、吲哚胺类、纤维蛋白原、二聚体、胶原等，蓝光区域激发主要是NADH、脂褐素、吲哚胺类、二聚体、核黄素等等。

这么多的物质均会造成自发荧光，小编认为采用化学方法逐个消除显然是不太现实的，而且可能会去除“真实”的抗原荧光。从整体上去把握，可能是一个更加可取的方式。

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自发荧光消除原则

3.1 标本固定

标本常规采用中性的多聚甲醛固定，而醛类固定剂会与胺和蛋白反应生成荧光产物，是造成自发荧光的重要因素之一。戊二醛的影响则是更大的。标本的固定时间不是越久越好，常规固定1-2天即可，最忌讳的就是采用长期浸泡在固定液中的组织进行免疫荧光标记实验。小编建议，为了尽可能是缩短固定时间，应该将组织切成适当的薄块（厚度不要超过5mm）后进行固定，而不是整个大组织块扔进去。

3.2 染色过程的控制

3.2.1 严格去除切片上的石蜡残留

所有石蜡切片在染色前都需要通过二甲苯去除石蜡。小编建议将这一步的时间延长至平时的一倍，即二甲苯①、二甲苯②、二甲苯③至少各停留30min。脱蜡记得烤片1h左右，提高脱蜡效率，也可使组织与玻片贴的更紧。

3.2.2 血清封闭

一般，大家都会采用动物血清，在室温下封闭1h左右。小编建议适当延长封闭的时间至2h。如果室温较低，可以考虑采用37℃孵育箱进行封闭，优化封闭时间，充分去除组织中的类属抗原。

封闭时使用的血清尽量采用高质量的国外产品。若血清质量不好，里面可能含有纤维蛋白原(正常血清是不含有纤维蛋白原的)，一旦沾到组织上，基本洗不掉了，也会增强自发荧光信号。此外，低质量的血清还包含有很多其它杂质。

3.2.3 一抗

之前小编在WB专题中就讲过，优质的一抗是免疫学实验的灵魂，尽可能的选用大品牌的、评价良好的单克隆抗体进行免疫荧光标记实验。

一抗的浓度需要预实验摸索，最好采用“棋盘法”进行浓度梯度预试。一抗浓度过高(本身荧光实验，一抗的浓度就较高)，也是造成自发荧光强的重要原因。这其中的原理目前并不清楚，但是很多人确实观察到了这一现象。

3.2.4 荧光二抗

采用进口的荧光二抗是非常重要的。因为低质量的荧光二抗中往往残留较多的未标记游离荧光素，游离的荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，它们的自发荧光也是很强的。有人曾建议采用层析或者透析的方式去除，但是其实操性往往不甚理想。最好的办法是采用进口的优质荧光二抗。

二抗孵育的时间也非常重要。很多人简单地将传统IHC的时间照搬过来，即37℃或者室温孵育30min，这可能是不合适的。小编认为最恰当的方法是通过充分的预实验来摸索二抗孵育时间和温度。二抗孵育时间过久，切片的自发荧光会很强，不容易洗掉。二抗孵育时间过短，目标抗原未充分结合，标记失败。小编再次建议这一步多做预实验。

3.2.5 阴性对照

必须要确定切片脱蜡之后，在不加二抗的情况下是否还能继续发荧光。这是我们判断是否存在自发荧光的金标准。

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切片的漂洗

为什么单独地将这一步拎出来呢？

因为免疫荧光实验，充分漂洗是非常必要的。如果很多时候，漂洗不干净会导致强烈的自发性荧光。这一点，在二抗孵育结束后的漂洗中显得尤为重要。

试想，如果您在荧光二抗孵育的步骤停留过久，而未经过充分漂洗，肯定会有较多的荧光二抗残留在组织切片上。因此，在适宜的二抗浓度下，充分的漂洗会极大减少自发荧光。

小编建议，至少二抗之后的漂洗要尽可能多洗几遍，5min*5次是可参考的。

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抗荧光衰减剂与荧光淬灭剂

现在很多的试剂商都供应了含DAPI的封片剂，不仅可以染核，还有防止荧光淬灭的成分。

对于表达水平较低的抗原来说，使用上述试剂无可厚非。而当你需要检测的组织抗原本身高表达且不易淬灭，那么此时还需要抗荧光淬灭剂吗？这种成分是否会导致自发荧光的长时间残留呢？

另外，市面上还有卖荧光淬灭剂的呢。品牌我就不说了，以免有打广告的嫌疑。

总之，这里面的权衡是我们需要考虑的。

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Evan's蓝或者台盼蓝

单标时，可以采用0.001%或至0.1%浓度的Evan's蓝或者台盼蓝染色，这种物质会均匀分布到组织或者细胞上，它能够结合不必要的固有荧光物质或背景性荧光物质，显著减少自发荧光。其原理是采用这种染料的结合效应，转移不必须的耦联着色物的能量，但是对目标抗原的影响较小。

多标时常常需要较多地消耗抗原的能量。对于表达较少或荧光信号较低的多标记实验而言，Evan's蓝或者台盼蓝染色可能会降低荧光信号的敏感度。

现在很多的试剂商都供应了含DAPI的封片剂，不仅可以染核，还有防止荧光淬灭的成分。

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图像采集

共聚焦显微镜的采集效果是要优于普通荧光显微镜的。

图像采集时，我们可以从整体上对图像进行调整。现在很多显微镜自带的图像软件上都有“伽马值”这个选项。合理的调整它，可以从整体上消除荧光背景。它是介于0.1-1.0之间的一个值，可以从整体上调节图像的亮度和对比度。

如果你需要调整此值的话，一个可供参考的选择范围就是0.75-1.0之间。

当然，我们必要要对整个批次的图像进行同样的伽马值设定，而不是某一张图片。

完结。

The end.