人-胃癌旁组织悬液制备

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注 | 以上操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整。

组织背景介绍

胃，居于膈下，腹腔上部。胃的上部称上脘，包括贲门；中部称中脘，即胃体部位；下部称下脘，包括幽门。

正常人的胃壁由四层结构组成，从内向外依次是粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜层。粘膜的浅层是上皮组织，有很多腺体，分泌胃酸，对食物进行化学性的消化。

粘膜层又可分为上皮，固有层和粘膜肌层。在正常胃粘膜中，上皮是由一组复杂的细胞系组成，包括粘液细胞、分泌细胞和内分泌细胞，它们协同工作以维持组织内环境平衡；固有层由结缔组织构成，其中含有大量的胃腺，分别是贲门腺、幽门腺、胃底腺。胃底腺由多种腺细胞组成，主要是主细胞和壁细胞；粘膜肌层为薄层平滑肌。粘膜下层由疏松结缔组织构成，含有淋巴细胞、肥大细胞及神经丛、血管和淋巴管。肌层发达，由内斜、中环和外纵三层平滑肌构成。外膜为一层浆膜，由间皮和少量的结缔组织构成。

本方案中，选用胰蛋白酶进行解离，胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶，对碱性氨基酸、精氨酸和赖氨酸的羧基参与的肽键具有特异性，可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸。

胃癌旁组织及胃组织示意图

材料和试剂耗材

实验流程

1. 取样后置于冰上的培养皿中，将组织切碎成0.5-1.5 cm3的小块；
2. 将10 mg左右切碎的组织转移到试管中。
3. 除去上清液，加入1 mL胰蛋白酶-EDTA（0.25 %），用保鲜膜密封离心管盖，并在37℃下振荡孵育30 min。
4. 孵育后，轻轻研磨样品，使用血清移液管将样品上下吹打6-8次，未能消化的组织块沉降到离心管底部。
5. 细胞悬液过30 μm筛于离心管中，离心管置于冰上，用预冷的PBS/BSA 0.04 %冲洗滤膜，并同时添加预冷的0.04 % PBS/BSA至总体积为10 mL。
6. 350 g，4℃离心5 min，去除上清液。
7. 如果组织含有大量的红细胞，需进行裂红操作（步骤7-10），添加1 mL红细胞裂解缓冲液，置于冰上2 min。
8. 2 min后，加入5 mL预冷的PBS/BSA 0.04 %中和；
9. 4℃，350 g离心5 min，去除上清，加入0.04 %预冷的PBS/BSA至10 mL。
10. 4℃，350 g离心5 min，尽可能多的去除上清。
11. 在冰上，用100 µL预冷的0.04 % PBS/BSA重悬细胞悬液，采用台盼蓝或荧光计数法对细胞数量和活性进行检测。

结果展示

所获细胞悬液：活率大于90 %，结团率低，背景干净。

注：胃癌旁组织易线粒体偏高，解离过程中如果细胞量足够最好做去死细胞处理。