如何快速定位到你所干扰的基因的功能

前面我们分享了：上下调差异基因那么多！如何定位目标基因呢？，需要一些生物学背景才能从成百上千的上下调基因里面的“拿到”自己感兴趣的基因，去开启一个课题。该文章是：《CECR2 drives breast cancer metastasis by promoting NF-B signaling and macrophage-mediated immune suppression》

既然作者经过自己的生物学背景知识对转录组数据差异分析结果定位到了CECR2基因，接下来就需要进行设计实验来读该基因进行敲减过表达的干扰，探索该基因的功能。其中大量的湿实验这里 就不赘述，感兴趣可以看该文章的：Fig. 3. CECR2 is required for migration, invasion, and metastasis.

总体上来说，CECR2基因在转移癌症里面的高表达量，抑制了免疫，起坏的作用，所以设计 CECR2 knockout (sg1 and sg2) 在LM2 细胞系，做转录组数据，数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE147993

GSM4451579 Control-1
GSM4451580 Control-2
GSM4451581 CECR2 sg1-1
GSM4451582 CECR2 sg1-2
GSM4451583 CECR2 sg2-1
GSM4451584 CECR2 sg2-2

在在LM2 细胞系的两种CECR2 knockout (sg1 and sg2)敲低组，都可以跟对照（在LM2 细胞系）进行对比，差异分析后功能富集，取交集：

两次差异分析这里作者并没有展现一些质量控制结果，也没有差异分析标准的火山图，热图等等，其实基本上转录组测序技术和芯片技术拿到的表达量矩阵后续分析大同小异：

• 解读GEO数据存放规律及下载，一文就够
• 解读SRA数据库规律一文就够
• 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够
• GSEA分析一文就够（单机版+R语言版）
• 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的
• 差异分析得到的结果注释一文就够

因为是两个两种CECR2 knockout (sg1 and sg2)敲低组，都跟对照（在LM2 细胞系）进行差异分析，所以两次差异分析就可以取交集，但是作者这个时候并没有对纯粹的成百上千个上下调基因去取交集，而是先把上下调通路找到，对通路取交集。蛮有意思的，The Venn diagram (A) shows the number of shared down-regulated hallmark pathways, and (B) the heatmap shows the eight shared down-regulated hallmark pathways. NES, normalized enrichment score.

但是这个时候，下调的生物学功能里面交集仍然是有8个， 但是不知道为什么作者为何这个时候仍然是对tumor necrosis factor–α(TNF-α) signaling by NF-κB 情有独钟，可能仍然是生物学背景吧。

然后呢，因为是表观基因，CECR2 was reported to form chromatin remodeling complexes with SNF2L or SNF2H; 所以作者合理的推测CECR2提供改变chromatin accessibility发挥生物学功能，所以加上 transposase-accessible chromatin using sequencing (ATAC-seq) ， 数据在：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE185647

GSM5621124 LM2 cells, Control_Rep1
GSM5621125 LM2 cells, Control_Rep2
GSM5621126 LM2 cells, CECR2 sg1_Rep1
GSM5621127 LM2 cells, CECR2 sg1_Rep2

也是两个分组的差异分析，仍然是拿到上下调基因。这个时候，作者关心的两个组学（ATAC-seq和RNA-seq）技术，共同下调的基因，可以看到是 111 down- regulated genes with decreased promoter-proximal ATAC-seq peaks。

继续对这111个基因 进行富集分析，如下所示：

形成了一个比较好的证据链：CECR2 knockout attenuates chro- matin accessibility to down-regulate target genes in the NF-κB pathway.

这个时候你还能说组学技术不重要吗，从前面我们分享了：上下调差异基因那么多！如何定位目标基因呢？，到现在我们分享的如何快速定位到你所干扰的基因的功能。虽然实验技术也不少，关于肿瘤migration, invasion, and metastasis的经典实验，但是ngs组学技术无疑也成为了标配，而且是多组学。