纳米免疫疗法通过促进先天和适应性免疫应答以增强恶性胸腔积液的PD-L1治疗

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题目：Intrapleural nano-immunotherapy promotes innate and adaptive immune responses to enhance anti-PD-L1 therapy for malignant pleural effusion 时间：2021年12月16日 期刊：Nature Nanotechnology (IF: 39.2) DOI: https://doi.org/10.1038/s41565-021-01032-w

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胸腔积液（pleural effusion）是以胸膜腔内病理性液体积聚为特征的一种常见临床症候。胸膜腔为脏层和壁层胸膜之间的一个潜在间隙，正常人胸膜腔内有5～15ml液体，在呼吸运动时起润滑作用，胸膜腔内每天有500～1000ml的液体形成与吸收，任何原因导致胸膜腔内液体产生增多或吸收减少，即可产生胸腔积液。按其发生机制可分为漏出性胸腔积液和渗出性胸腔积液两类。

恶性胸腔积液 (MPE) 是晚期恶性肿瘤的指征，具有致命的预后。MPE 患者的平均生存期为 4-9 个月。胸腔积液的积累通常会导致呼吸困难，严重损害生活质量。MPE目前的标准治疗包括导管引流或化学/手术胸膜固定术，但主要是姑息性的。通常，两个不同的肿瘤微环境区室，积液和播散性胸膜肿瘤，在胸膜腔中共存，对治疗干预和药物递送提出了重大挑战。临床证据表明，MPE 包含大量具有促肿瘤表型的肿瘤相关髓系细胞，从而损害抗肿瘤免疫力。在这里，我们开发了一种负载有环状二核苷酸 (LNP-CDN) 的脂质体纳米颗粒，用于靶向激活巨噬细胞和树突细胞中干扰素基因信号传导的刺激物，并表明，在胸膜内给药时，它们会引起 MPE 转录环境的剧烈变化，从而减轻积液和胸膜肿瘤中的免疫冷型 MPE。此外，联合免疫疗法与阻断PD-L1 有效地减少了 MPE 体积并抑制了胸膜腔和肺实质中的肿瘤生长，从而显著延长了携带 MPE 的小鼠的生存期。此外，在临床 MPE 样本中也观察到 LNP-CDN 诱导的免疫学效应，表明胸膜内 LNP-CDN 用于临床 MPE 免疫治疗的潜力。

样本信息/实验设计

为了克服免疫冷MPE，我们合成了CDN负载的磷脂酰丝氨酸（PS）包被的脂质体（LNP-CDN），其在MPE中显示出良好的药代动力学特征和胸腔内吞噬细胞的选择性靶向。加载与磷酸钙（CaP）复合的CDN能够使CDN从内体向细胞质基质的pH响应性释放，在那里它指示STING启动STING信号传导。

为了深入了解胸腔内LNP-CDN对个体免疫细胞群的免疫学影响，我们在小鼠模型中对MPE进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。

然后，我们研究了LNP-CDN诱导的促炎性MPE和PD-L1的上调是否会为小鼠模型中针对MPE的抗PD-L1免疫疗法的反应奠定基础。

此外，获得非小细胞肺癌（NSCLC）患者的MPE样本，以证明LNP-CDN在小鼠中诱导的免疫作用可以在人类中重现。

单细胞测序技术

10x Genomics Chromium Single Cell 3' Reagent Kit V3

主要结果解析

1. 胸膜内给药LNP 靶向 MPE和胸膜肿瘤中的吞噬细胞

合成的LNP-CDN纳米颗粒的平均直径约为120 nm，负表面电荷为−15 mV（图1a）。使用Lewis肺癌（LLC）小鼠开发了胸腔积液和胸膜表面的多灶性肿瘤MPE模型，通过体内磁共振成像（MRI）和尸检（图1a）可以清楚地看到。胸腔内注射1，1'-二十八烷基-3，3，3'，'3'-四甲基吲哚三碳氰胺碘化物（DiR）标记的LNP后不同时间的体内成像系统（IVIS）清楚地表明，大多数信号留在胸部区域并持续至少48小时（图1b，c）。离体IVIS在胸膜肿瘤，肿瘤引流淋巴结（TDLNs），肺和肝脏中检测到DiR-LNP信号（图1d）。血液和其他主要器官中的DiR-LNP很少。胸膜内DiR-LNP处理后从MPE收集的细胞的免疫细胞化学显示，主要富集在CD11c单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞（DC;图 1e）。胸膜肿瘤组织的免疫组织化学描绘了LNP分散良好，其与CD11c单核细胞/巨噬细胞和DC共定位（图1f）。我们的流式数据显示，DiR-LNP主要由巨噬细胞，CD103 DC和CD11b DC捕获，而在MPE，胸膜肿瘤和TDLN的肿瘤细胞，T细胞或自然杀伤（NK）细胞中观察到最少的摄取（图1g-i）。CD103 DC被认为是与CD8 T细胞相互作用最有能力的APC.总之，这些数据表明，胸膜内LNP-CDN能够在MPE和胸膜腔中的胸膜肿瘤中实现吞噬细胞靶向递送CDN。值得注意的是，LNP-CDN本身或由APC携带的LNP可以从MPE迁移到TDLN，这可能增强了TDLN中APC介导的细胞毒性T细胞的交叉启动。

图1

• a，建立小鼠MPE模型并胸腔内注射直径为120 nm的LNP-CDN，通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射测量。MRI 和尸检证实了源自 LLC-Luc 细胞的胸腔积液和胸膜肿瘤的发展。
• b-c，胸膜内 DiR 标记的 LNP 后随时间的体内 IVIS 成像 (b) 和定量光子计数 (c)。
• d，来自接受胸膜内 DiR-LNP 的 MPE 小鼠主要器官的代表性离体 IVIS 成像（三个独立实验）。DLN，引流淋巴结；LU，肺；LV，肝脏；TM，（胸膜）肿瘤。数据显示为平均值 ± s.d。每个时间点 n = 3 只生物学独立的小鼠。比例尺，黄色到深红色，信号强度从高到低。
• e，从 MPE 胸膜内 DiR-LNP 处理后 24 小时收集活细胞用于免疫荧光显微镜检查。双染色显示 DiR-LNP（红色）主要与 CD11c+ 吞噬细胞（绿色）共定位。LLC-Luc 肿瘤细胞（紫色），4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）；比例尺，20 μm。三个独立实验的代表性图像。
• f，胸膜腔内 DiR-LNP 后 24 小时从胸膜腔解剖出一个具有代表性的胸膜肿瘤。免疫荧光染色显示 DiR-LNPs 在肿瘤内渗透良好并与 CD11c+ 吞噬细胞共定位。整个胸膜肿瘤，比例尺，250 μm；顶部比例尺，100 μm；底部比例尺，50 μm。三只独立动物的代表性图像。
• g-i，胸膜内 DiR-LNP 后不同时间的流式细胞术分析确定了 MPE（g）胸膜肿瘤（h）和 TDLNs（i）中 DiR+ 细胞在其各自群体中的百分比。数据显示为平均值 ± s.d。n = 3 只生物学独立的小鼠。

2.胸膜内 LNP-CDN 将免疫抑制性骨髓细胞重编程为促炎表型并重塑 MPE 中的免疫景观

为了阐明MPE中的免疫景观及其对胸腔内LNP-CDN的反应，我们无偏倚地应用scRNA-seq来表征胸腔内PBS，LNP-CDN，抗PD-L1抗体（Ab）或LNP-CDN抗PD-L1 Ab后的细胞类型特异性转录谱。每种条件下来自三只LLC MPE小鼠的约4，000个单细胞经受scRNA-seq。如（t-SNE）投影所示，无监督聚类挑出20个不同的细胞簇，包括肿瘤细胞和单核细胞/巨噬细胞，嗜中性粒细胞，DC，NK，CD4 T细胞和CD8 T和B细胞的各种免疫细胞（图2a，b）。显然，MPE含有大量的骨髓细胞，包括巨噬细胞（Cd68和Adgre1;~55%）和嗜中性粒细胞（Ly6g;~30%）。巨噬细胞群的深度scRNA-seq聚类产生了六个亚簇（图2c）。Mac_3，Mac_4和Mac_6仅在单独使用LNP-CDN或与抗PD-L1 Ab联合使用后诱导（图2c-e），其显示显着上调的M1相关基因（补充图3）。相比之下，表现出高表达M2相关基因的Mac_1和Mac_2主要在PBS对照组或抗PD-L1单独组中发现，而Mac_5是来自每种处理的细胞的混合物（图2c-e和补充图3）。

为了研究巨噬细胞极化过程中的转录组动力学，我们应用了Monocle2方法进行轨迹分析。Monocle确定并沿着两种替代细胞命运的轨迹的单细胞排序，即M2和M1（图2f和补充图4）。Mac_1和Mac_2靠近M2命运，而Mac_3 Mac_6更接近M1命运（图2f）。LNP-CDN单独或组合明显诱导巨噬细胞复极化和从M2到M1命运的逐渐过渡（图2g）。此外，轨迹热图揭示了基因表达的顺序变化（图2h）。显然，在从M2到M1的转换过程中，基因的表达逐渐上调或下调（图2i和补充图4）。此外，我们通过提取功能基因本体（GO）术语和生物学途径（KEGG）检查了与这些过渡基因相关的丰富功能。我们确定了与抗原处理和呈递相关的基因富集，以及与M2至M1极化期间的炎症反应相关的生物学过程（图2j）。

为了验证scRNA-seq免疫表型，我们进行了流式细胞术，发现LNP-CDN确实将MPE和胸膜肿瘤中的M2（F4 / 80 + 精氨酸酶1）偏向于M1样巨噬细胞（F4 / 80 + iNOS）（图2k，l）。相反，胸膜内游离CDN没有免疫学作用，这可能是由于ENPP1快速降解CDN的结果。胸腔内LNP-CDN加抗PD-L1 Ab进一步增强了M1 / M2的比例（图2k，l）。酶联免疫吸附测定（ELISA）还检测到胸膜内LNP-CDN后MPE中促炎细胞因子和趋化因子（例如I型IFN，干扰素γ（IFN-γ），白细胞介素（IL）-2，IL-12和IL-15-IL-15R复合物的水平升高（图2m）。总之，这些数据清楚地表明，MPE中的TME具有深度免疫抑制作用，富含M2 / N2样骨髓细胞，但胸膜内LNP-CDN有效地将这些髓系细胞重新极化为促炎表型。

图2

• a，48 小时后获得的合并的整个 MPE 细胞（每个处理 n = 3 只小鼠）的无监督 scRNA-seq 显示 20 个颜色编码的细胞簇。
• b，按处理颜色编码的所有细胞的 t-SNE 图。
• c，来自所有四种治疗的六种颜色编码的胸膜内巨噬细胞亚群的 t-SNE 亚群。
• d、e、t-SNE 图，按处理 (d) 和条形图 (e) 进行颜色编码，显示在 LNP-CDN 或联合处理与单独的 PBS 或抗 PD-L1 之间明显分离的巨噬细胞亚群，其中 Mac_3， Mac_4 和 Mac_6 是 LNP-CDN 独有的或与抗 PD-L1 结合使用的。f，叠加在伪时间轨迹上的巨噬细胞亚群（Mac_1 到 Mac_6）。
• g，叠加在由处理颜色编码的伪时间轨迹上的巨噬细胞。
• h，差异表达基因的热图，基于它们在 M2 到 M1 复极期间通过伪时间的共同动力学排序。单元格（列）沿 M2 到 M1 路径排序。
• i，参与 M2 至 M1 复极化的转录因子的代表性基因表达绘制为伪时间的函数。散点图中的每个点代表单个细胞的基因表达。
• j，基于 M2 到 M1 复极化中逐渐上调（红色）和下调（绿色）的基因，在 GO 和 KEGG 分析中选择了显著丰富的term。完整列表可在补充表 1 中看到。
• k，l，代表性流程图 (k) 显示胸膜内 LNP-CDN 诱导的 iNOS 表达右移（M1 样标记），而精氨酸酶 1 左移（M2 样标记） ) 在 MPE 和胸膜肿瘤中的巨噬细胞上，并且 M1:M2 (l) 的比率增加。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。Tukey 事后检验的单向方差分析。
• m，在指定治疗下胸膜液中各种细胞因子和趋化因子的 ELISA。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。

3.胸膜内 LNP-CDN 促进多功能 CD8+ 效应 T 细胞，扩大干细胞样记忆 CD8+ T 细胞，并在 MPE 中产生肿瘤特异性细胞毒性 T 细胞。

除了对骨髓细胞的影响外，胸膜内LNP-CDN还导致MPE浸润的CD8 T细胞显著扩增（图3a和补充图6和7）。scRNA-seq描绘了CD8 T细胞的五个不同的亚群（图3b）。CD8_3和CD8_4主要在胸膜内LNP-CDN后诱导，在较小程度上由抗PD-L1 Ab诱导（图3b，c）。虽然两个亚簇都表现出效应分子（Ifng，Prf1，Gzmb和Klrg1）和共刺激受体（Cd28和Icos）的上调表达，与激活效应子表型一致，但发现CD8_4具有更高的细胞周期转录本表达（Cdk1，Mki67和Pcna）（图3d，e).CD8T_1，也在很大程度上被LNP-CDN扩展，呈现出一种幼稚样表型（Tcf7，Ccr7，Pdcd1）但也表达了高水平的干细胞抗原1（Sca-1或Ly6a），造血干细胞移植基因Hoxa1和Lpxn以及记忆标记物，如Il2rb和Cxcr3（图3d，e），可能与干样记忆CD8 T表型有关。相反，PBS处理下的大多数T细胞位于CD8_2和CD8_5（图3b，c），其中CD8_2显示Ccr7，Il7r和Tcf7的高表达，但Cd44的表达较低，可能表明幼稚样T细胞，而CD8_5表达高水平的毒素，Pdcd1，Lag3和Ctla4（图3d，e和补充图8）， 通常与 T 细胞衰竭有关。我们还将Monocle2应用于CD8 T细胞并产生了三叉轨迹（补充图9）。与t-SNE表征一致，CD8T_1和CD8T_2在记忆/幼稚分支中丰富，CD8T_3和CD8T_4主要位于效应分支中，而CD8T_5主要在耗尽分支中发现（补充图9）。在响应LNP-CDN或LNP-CDN抗PD-L1时，发现CD8 T细胞在效应轨迹上积聚，一些在记忆/朴素轨迹上积聚（补充图9）。同样，bulk RNA-seq分析表明，联合免疫疗法在多个信号通路中富集了与T细胞增殖和活化、分化和迁移以及T细胞介导的免疫和细胞毒性相关的基因（补充图10和11）

值得注意的是，单独使用LNP-CDN或与抗PD-L1 Ab联合使用显著增加了MPE和胸膜肿瘤中具有IFN-γ和颗粒酶B（Gzmb）的多官能CD8 T细胞的数量（图3f，g和补充图7）。利用含有LLC-卵清蛋白（OVA）MPE的小鼠，我们的数据显示CD103 DC对外源性OVA-荧光素异硫氰酸酯（FITC）的摄取（补充图12）以及MPE胸膜肿瘤和TDLN中CD103 DC上SIINFEKL-MHC I类复合物的呈递显著增加（图3h，i）。LNP-CDN还导致MPE中SIINFEKL四聚体CD8 T细胞增加十倍以上（图3j，k）;在胸膜肿瘤，TDLN和脾脏中也观察到SIINFEKL四聚体CD8 T细胞的显著增加（补充图7和13）。在MPE小鼠的不同队列中，对来自相同个体的MPE的分析表明，单次胸腔内剂量的LNP-CDN或LNP-CDN抗PD-L1能够促进促炎TME并激活MPE中的CD8 T细胞及其细胞毒性功能（补充图14和15）。综上所述，这些数据表明，胸腔内LNP-CDN促进肿瘤抗原（TA）的APC传递和肿瘤特异性CD8 T细胞的交叉启动，并扩大了MPE中多官能效应CD8 T细胞和干细胞样记忆CD8 T细胞的群体。

图3

• a，胸膜内 Cd8a+ T 细胞的 t-SNE 图，按治疗进行颜色编码。
• b，t-SNE 投影，显示由亚群颜色编码的 Cd8a+ T 细胞。
• c，条形图显示每个簇内 Cd8a+ T 细胞的比例作为处理的函数。
• d，投影到 Ifng、Gzmb、Cd28、Mki67、Cd44 和 Tcf7 的 t-SNE 图上的基因表达模式（尺度，log2 倍数变化）。e，热图显示了 b 中所示的子集群 1-5 中差异表达的单个基因的 z 分数。a-e 数据来自一项实验，每次处理汇集 n = 3 个 MPE 样本。子簇之间的完整差异表达基因列表在补充表 4 中提供。
• f，流程图显示多功能 CD8+ T 细胞，对 IFN-γ 和 Gzmb 具有双阳性染色。
• g，双阳性染色的细胞数量。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。Tukey 事后检验的单向方差分析。
• h，i，MPE、胸膜肿瘤和 TDLNs 中 CD103+（CD11c+、CD103+、CD11b-）DC 上 OVA 肽 SIINFEKL-MHC I 类分子 Kb 复合物的代表性流程图（h）和定量数据（i）。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。Tukey 事后检验的单向方差分析。
• j,k，在指定处理下 MPE 中 SIINFEKL 四聚体 + CD8+ T 细胞的代表性流程图 (j) 和定量数据 (k)。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。使用 Tukey 的 pos-hoc 检验的单向方差分析。

4.LNP-CDN 促进 NK 细胞的效应功能和细胞毒活性。

最近的临床研究表明，MPE中的NK细胞呈现低细胞毒性表型.我们研究了胸腔内LNP-CDN是否可以重振MPE中NK细胞的抗肿瘤功能。scRNA-seq分析揭示了PBS和LNP-CDN处理之间不同的聚类模式（图4a，b）。NK_2和NK_3在胸腔内LNP-CDN（图4c）后显著扩增，其表现出编码激活NK受体（Ncr1，Klrk1，Fcgr3，Klra8和Klra4），效应分子（Ifng，Gamb和Prf1）和激活转录因子（Irf8，Zeb2和Cbfb）（图4d，e）的基因表达增加).相反，PBS控制下的NK细胞被限制在NK_1（图4b，c），表达与抑制性NK受体（Klra1，Klra3和Klra6）相关的高水平基因（图4d，e）。与t-SNE簇一致，轨迹分析表明LNP-CDN或LNP-CDN抗PD-L1使NK细胞从未成熟状态向成熟状态倾斜（补充图16）。

流式检测显示，胸腔内LNP-CDN联合或不联合抗PD-L1 Ab促进了IFN-γ和Gzmb的多功能产生（图4f，g），以及激活的Fcγ受体（FcγR）CD16在NK细胞中的表达（图4h，i和补充图17）。此外，体外肿瘤细胞杀伤测定表明，与PBS对照组相比，从用LNP-CDN预处理的MPE中分离的NK细胞杀死的LLC细胞明显更多（图4j）。添加抗PD-L1抗体导致更多的LLC细胞死亡（图4j和补充图18）。除了破坏PD-1-PD-L1轴的功能外，已知抗PD-L1的IgG2b同种型10 F.9G2与小鼠FcγRs相互作用以诱导抗体依赖性细胞细胞毒性（ADCC）对抗PD-L1肿瘤细胞.事实上，抗PD-L1 F（ab'）2在上述细胞溶解研究中发现具有较低的细胞毒性。总之，这些数据表明胸膜内LNP-CDN改善了NK细胞的细胞毒性活性，通过阻断PD-1 / PD-L1相互作用和ADCC效应与抗PD-L1 Ab结合，进一步增强了NK细胞的细胞毒性活性

图4

• a，t-SNE 投影显示 MPE 中 Klrb1c+ NK 细胞的三个颜色编码亚群。
• b，a 中的 t-SNE 图，按处理进行颜色编码。
• c，条形图显示每个簇内 NK 细胞的频率作为治疗的函数。
• d，投影到 Gzmb、Ifng、Prf1、Fcrg3、Ncr1 和 Klra4 的 t-SNE 图上的基因表达模式（log2 倍数变化）。
• e，热图显示来自 a 的每个子集群中差异表达的单个基因的 z 分数。a-e 数据来自一项实验，每次处理汇集 n = 3 个 MPE 样本。
• f，流图显示多功能 NK 细胞，IFN-γ 和 Gzmb 双阳性染色。
• g，双阳性染色的细胞数量。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。Tukey 事后检验的单向方差分析。
• h，i，在指定处理下 NK 细胞中 CD16 表达的代表性流程图 (h) 和定量数据 (i)。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。Tukey 事后检验的单向方差分析。
• j，在 IgG2b 同种型、抗小鼠 PD-L1 或 PD-L1 F(ab')2 存在下，在指定的治疗下，从 LLC 小鼠的 MPE 分离的 NK 细胞的离体细胞杀伤。数据显示为平均值 ± s.d。n = 3 个生物学独立的实验。Tukey 事后检验的单向方差分析。

5.胸膜内 LNP-CDN 与抗 PD-L1 Ab 联合使用可抑制胸膜肿瘤生长，减少 MPE 体积并延长 MPE 小鼠的生存期。

众所周知，IFN可诱导PD-L1作为反监管机制.发现LNP-CDN在转录本和蛋白质水平上增加肿瘤细胞上PD-L1和MHC I类的表达（补充图19）。因此，联合抗PD-L1抗体来抵消过度表达的PD-L1可能是增强抗癌免疫力的合理策略。PD-L1抗体通常全身给药。为了探索替代给药，我们在这项研究中比较了胸腔内（ip.）注射PD-L1 Ab与腹腔内（ip.）。药代动力学数据显示，胸膜内在3小时和24小时分别实现了PD-L1 Ab胸膜浓度的10倍和3倍（补充图18）。胸腔内PD-L1也导致胸膜肿瘤和TDLN中的Ab浓度显著升高，但血液浓度要低得多（补充图18）。因此，我们在治疗研究中纳入了胸膜内PD-L1 Ab，但小于ip剂量（100μg）的三分之一。胸腔内LNP-CDN或抗PD-L1（30μg）单药治疗延迟肿瘤生长和MPE进展;联合治疗导致MPE体积和胸膜肿瘤负荷进一步降低，野生型但未STING的生存期显著延长。携带LLC的小鼠稳定地转染了萤火虫荧光素酶（LLC-Luc）MPE（图5a-f和补充图18）胸腔内抗PD-L1 Ab和全身性抗PD-L1抗体的生存获益无显著差异（图5c）。在CMT-167-Luc MPE模型中也观察到了类似的抗肿瘤免疫反应和联合免疫疗法的治疗效果（图5g-j和补充图20和21）。胸膜肿瘤的免疫组织化学显示，联合治疗诱导的凋亡细胞明显更多（图5k，l）。与在PBS控制的胸膜肿瘤中观察到的扩大和扭曲的血管生成血管相反，单独或组合使用LNP-CDN导致"正常化"的血管（图5m-p）。通过批量RNA-seq，发现联合处理可以上调血管正常化/稳定基因和抗血管生成基因的表达，同时下调促血管生成基因（补充图10和11）。

图5

• a，在第 4 天和第 14 天用 BLI 监测接受指定治疗的小鼠的胸膜内肿瘤负荷。
• b，胸部区域内的定量光子计数。数据显示为平均值 ± s.d。n = 6 只生物学独立的小鼠。Tukey 事后检验的单向方差分析。
• c，使用指定治疗的 LLC MPE 小鼠的 Kaplan-Meier 存活试验。LNP-CDN+ PD-L1组n = 10，其他组n = 8。分别在 LNP-CDN 与 PBS 中 P = 0.012 和在 PD-L1 与 PBS 中 P = 0.0056；双边对数秩检验。
• d-f、MPE 体积 (d)、通过流式细胞术 (e) 在 MPE 中的非血液细胞 (CD45-) 计数和胸膜肿瘤重量 (f) 在第 14 天在 LLC-Luc MPE 小鼠中测量 (n = 6在 PBS 和 CDN 组中，n = 7 在另一组中）。数据显示为平均值 ± s.d.；Tukey 事后检验的单向方差分析。
• g-j，CMT167-Luc MPE 小鼠的 Kaplan-Meier 存活试验，具有指定的治疗 (g)、MPE 体积 (h)、MPE (i) 中的非血液细胞 (CD45-) 计数和胸膜肿瘤重量 (j)在 CMT167-Luc MPE 小鼠的第 14 天。LNP-CDN+ PD-L1组n = 10，其他组n = 8用于生存分析；LNP-CDN 与 PBS 中的 P = 0.011；双边对数秩检验。对于 h-j 中的 MPE 评估，每组 n = 6。数据显示为平均值 ± s.d。生存分析的双边对数秩检验，单向方差分析和 Tukey 的事后检验。
• k-p，活性 caspase3+ 凋亡细胞的免疫组化染色 (k) 和定量 (l)，CD31+ 细胞的免疫组化染色 (m) 和定量 (n) 以及 CD31+ 和 NG2+ 细胞的免疫荧光染色 (o) 和定量 (p)在指定的治疗下，n = 3 具有 LLC-Luc MPE 的生物学独立小鼠的胸膜肿瘤。数据显示为平均值 ± s.d。比例尺，20 µm (k) 或 50 µm (m 和 o)。Tukey 事后检验的单向方差分析。

6.LNP-CDN 可重编程肿瘤相关巨噬细胞，激活细胞毒性效应 NK 细胞和 CD8+ T 细胞，并增强 NSCLC 患者 MPE 中 NK 细胞的细胞毒活性。

为了评估胸腔内LNP-CDN的转化潜力，我们在NSCLC患者的胸腔穿刺术期间获得了临床MPE样本（n = 5名患者），并确认了MPE细胞学检查（图6a）。MPE的流式细胞术鉴定出肿瘤细胞（约30%）和多种免疫细胞（约60%），个体患者之间的差异范围很广（图6b）。在免疫细胞中，CD3 T细胞，单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞更为普遍。尽管T淋巴细胞的比例很高，但CD8 T细胞的比例远低于CD4 T细胞，并且存在相当数量的CD4调节性T细胞（图6b）。从每个患者的MPE中分离出的单核细胞/巨噬细胞表现出M2相关基因的均上调表达（图6c）。ELISA在MPE中检测到低水平的IFN和其他促炎细胞因子/趋化因子（补充图25）。这些数据与先前的临床观察结果非常一致，表明免疫性冷MPE。

为了研究LNP-CDN在人MPE中的效用，我们首先通过将DiR-LNP与新鲜MPE或从MPE中分离的巨噬细胞一起孵育来评估其靶向特异性（补充图26和27）。流式细胞术和免疫荧光显微镜显示，单核细胞/巨噬细胞和DC主要摄取DiR-LNP（图6d，e）。接下来，我们研究了LNP-CDN对MPE中各种免疫细胞的离体效应。LNP-CDN与分离的巨噬细胞的孵育诱导所有五个患者样本中M1相关基因的表达增加（图6c，f）。我们还从单个样品中分离了NK细胞，并用上述LNP-CDN处理的巨噬细胞的上清液处理了NK细胞（补充图27）。流式细胞术检测到激活受体，NKG2D的表达和细胞内IFN-γ的产生显着增加（图6g，h）。此外，LNP-CDN与新鲜MPE的孵育导致所有五个样品中IFN-γ CD8 T细胞急剧增加（图6i）。此外，LNP-CDN激活的NK细胞显示出自体肿瘤细胞的细胞溶解增强（图6j）。由于所有样品中胸膜肿瘤细胞上PD-L1水平的可变表达（图6k），结合阿维单抗，临床批准的IgG1抗PD-L1单克隆Ab，进一步增加了NK细胞毒性（图6j）。总之，这些数据支持胸腔内LNP-CDN在人MPE中的潜在应用。

图6

• a，用 LNP-CDN 治疗患者 MPE 的方案。
• b，通过流式细胞术测定的从 NSCLC 患者（n = 5）中新鲜获得的 MPE 的细胞组成。每个点代表一个单独的 MPE 样本。肿瘤和CD45+细胞是活细胞的百分比；其他免疫细胞为CD45+细胞的百分比。数据显示为平均值 ± s.d。c，基因表达谱的成对比较显示 LNP-CDN 诱导 M1 相关基因，同时抑制巨噬细胞中的 M2 相关基因。热图数据显示为归一化为正常人类 PBMC 的平均 log2 倍变化。
• d，流式细胞仪检测患者 MPE（n = 5）中巨噬细胞和 DCs 对 DiR-LNP 的特异性摄取。显示了它们自己群体中 DiR+ 细胞的百分比。数据显示为平均值 ± s.d。
• e，从代表性患者的 MPE 中分离出的巨噬细胞（绿色）摄取 DiR-LNP（红色）的免疫荧光成像。比例尺，20 µm。三个独立实验的代表性图像。
• f，流图显示 LNP-CDN 处理单个 MPE 样品后 M1 (CD80)/M2 (CD206) 的比率增加 (n = 5)。
• g,h，LNP-CDN 激活患者 MPE 中的 NK 细胞（n = 5）。来自患者 MPE 的分选 NK 细胞与来自 LNP-CDN 处理的巨噬细胞的上清液共培养 18 h；通过流式细胞术测定NKG2D（g）的细胞表面表达和IFN-γ（h）的细胞内表达。
• i，LNP-CDN 激活患者 MPE 中的 CD8+ T 细胞（n = 5）。
• j，LNP-CDN增强的NK细胞细胞毒性和PD-L1 Ab介导的ADCC。数据显示为平均值 ± s.d。n = 5 个患者样本。Tukey 事后检验的单向方差分析。
• k，在五名个体患者的样本中观察到的肿瘤细胞上 PD-L1 的异质表达。数据显示为平均值 ± s.d。n = 3 个生物学独立的实验。

总结

1. 小鼠和人类的MPE具有高度的免疫抑制作用，具有丰富的肿瘤促进骨髓细胞。
2. 开发了CDN负载的脂质体纳米颗粒LNP-CDN，它保护CDN免受MPE中的酶降解，并表现出其对巨噬细胞和DC的特异性靶向以激活STING信号传导
3. 通过scRNA-seq，发现胸腔内LNP-CDN通过重新编程骨髓细胞，激活DC进行TA交叉表达，促进多功能NK细胞和CD8 T细胞以及扩增干细胞样记忆CD8 T细胞来诱导MPE转录景观的剧烈变化。
4. MPE的成功管理可以重新获得与其他治疗方案相结合的机会，以最大限度地提高治疗效果