Nature子刊！肺癌四个阶段的单细胞转录图谱！

导语

GUIDE ╲

肺癌是死亡人数最多的癌症，然而肺癌进展中分子和细胞的时空变化仍然未知。

背景介绍

今天小编为大家带来一篇NC的单细胞经典范例文章，作者使用单细胞测序揭示了肺腺癌进展的四个阶段中细胞和分子水平的变化。文章题目为Deciphering cell lineage specification of human lung adenocarcinoma with single-cell RNA sequencing，上周刚刚发表。

数据介绍

对四个组织学阶段（非典型腺瘤性增生 (AAH)、原位腺癌 (AIS)、微浸润性腺癌 (MIA)、显性浸润性肺腺癌 (IA)）的25名患者的52份样本以及18份匹配的正常肺样本进行了单细胞RNA测序。本研究生成的WES、WGS和RNA-seq数据已存入北京基因组研究所基因组序列档案馆(Genome Sequence Archive, GSA)，登录号为HRA001130。

结果解析

01

肺腺癌进展中的细胞异质性

从肺腺癌四种不同组织学亚型的25名患者中收集了总共52个肺标本进行单细胞测序（图1a ），以及18个相邻的正常肺来自同一叶内远端区域的组织作为对照。

为了识别不同细胞群的不同转录谱，使用Seurat包进行了降维和无监督细胞聚类。根据关键标记基因表达确定了细胞cluster，并将它们分配给16种主要细胞类型（图1b-d），包括上皮类型（纤毛、棒状、基底、AT1、AT2和AT2样）细胞）和基质类型（内皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和骨髓细胞）。

对正常和肿瘤上皮细胞类型的分析揭示了一组与AT2细胞（AT2样细胞）非常相似的细胞，并且富含恶性细胞群（图1b-d）。四个组织学阶段中正常细胞和恶性细胞之间的比较表明，大多数正常细胞是免疫细胞，并且每个细胞cluster都包含来自多个患者的细胞（图1c）。

在从正常肺到AAH、AIS、MIA和IA的过程中，某些细胞类型的频率变化很大。例如，在肿瘤进展过程中T和B淋巴细胞的富集以及自然杀伤 (NK) 细胞和粒细胞的减少，表明适应性免疫反应的激活。这些结果说明肺腺癌内的高水平转录组异质性，在进展过程中可能至少部分受到周围微环境的调节。

图1

鉴于之前的研究表明AT2细胞是肺腺癌的起源，作者计算了不同细胞类型之间基因表达水平的相关系数，发现AT2样细胞与AT2细胞密切相关。值得注意的是，表达细胞增殖标志物的细胞百分比非常小，因此不校正细胞周期效应。总之，AT2样细胞与恶性细胞群相关，并且AT2细胞可能是肺腺癌的起源。

02

正肺腺癌不同阶段上皮细胞的表征

肺上皮细胞因其在肺癌和各种肺部疾病（如哮喘和纤维化）中的作用而被广泛研究。因此，作者比较了来自肺腺癌四个组织学阶段的正常和肿瘤上皮细胞的转录组。

作者确定了15,984个上皮细胞并将它们分为10个亚群（图2a-c）。根据已知标志物的表达谱，上皮细胞图谱主要由AT1细胞（PDPN和AGER）、AT2细胞（HHIP、SFTPC和SFTPA）、基底细胞（Krt5 和TP63）、纤毛细胞（FOXJ1 和 CCDC78）和AT2样细胞（MDK和SFTPB）。与先前研究相似，正常上皮细胞显示出五个亚群，这些亚群表达了上述六种细胞类型的明确上皮标志物（图 2b、c）。

图2

在肿瘤组织中，上皮细胞可能含有恶性肿瘤细胞群中残留的正常细胞。在这里，使用inferCNV在上皮细胞上基于大规模体细胞拷贝数变异（CNV）事件区分肿瘤和正常细胞（图 2d、e）。使用来自正常肺组织的细胞类型作为健康参考来估计四个组织学阶段肿瘤的CNV。染色体扩增（红色）和缺失（蓝色）被映射到图3d中AT2样细胞的每个染色体位置（列）。

结果表明AT2样细胞在IA阶段获得了大规模的染色体CNV。具体而言，AT2样细胞在整个癌症进展过程中表现出染色体获得/丢失事件的逐渐增加，而其他上皮细胞亚型几乎没有或没有体细胞CNV（图2e）。 因此，强有力的遗传证据支持AT2细胞是肺腺癌的起源。

接下来，作者采用单细胞调节网络推理和聚类 (SCENIC)来评估上皮细胞中转录因子 (TF) 表达水平的差异。发现RFX家族基序在纤毛细胞中高度激活，并且MYC和HES1 在基底细胞中高度上调（图2f）。

值得注意的是，肺命运TFs Nkx2-1和AT2细胞身份TFs Etv5在正常AT2细胞簇中富集。相比之下，TFs HSF1、CEBPG和FOXQ1在AT2样细胞中高度上调。HSF1过度表达在肺癌中很常见，并且与肿瘤血管生成相关，而早期肺癌细胞和基质中的 HSF1 激活与较差的结果相关。TF CEBPG与气道上皮中的抗氧化和DNA修复基因相关，并与肺癌的易感性相关。因此，AT2和AT2样细胞的TF有助于驱动LUAD肿瘤发生和进展。

最后作者使用免疫荧光染色验证了AT2细胞作为肺腺癌起源。

03

肺腺癌起源AT2细胞的转录轨迹

为了确定在从正常细胞到癌细胞的过程中控制细胞命运转变的关键分子事件，作者选择了与AT2细胞和AT2样癌细胞非常相似的细胞簇，然后沿着肺腺癌发展的四个阶段追踪基因表达变化。

基于Monocle2进行了pseudotime分析（拟时分析）并观察到非随机表达模式（图3a-c）。轨迹中的转录状态揭示了肿瘤中与进展相关的变化。早期（AAH或AIS）的肿瘤细胞聚集在一端，而晚期肿瘤组织（MIA或IA）的细胞在另一端（图3a）。

作者共鉴定了283个差异表达的基因，这些基因在pseudotime分析内表现出动态表达（q<0.05），并将它们分为四组（1-4）。然后，沿着pseudotime对这些基因进行排序并重建扩散图（图3b）。虽然这些表达模式中的每一种都出现在不同的时间，但一旦发生，它们都会在肿瘤中持续存在，因此更晚期的肿瘤包含更多不同状态的细胞。

作者接下来检查标记基因表达沿pseudotime的变化（图3c）。JUN、TIMP1和MDK在IA阶段高表达，而LAMP3随着肺腺癌的进展显着减少。升高水平的MDK也被确定为区分IA阶段LUAD31的最重要特征之一。这些结果强调MDK和TIMP1作为肺腺癌发病机制的潜在生物标志物。

图3

在过滤掉在所有细胞中不到10%表达的基因后，作者检查了AT2和AT2样细胞簇中3613个基因之间的遗传相互作用（图3d）。在正常组织中上调的基因与肺表面活性剂相关蛋白和体内平衡有关。相比之下，肿瘤中上调的基因参与代谢、核糖体活性或 MHC II类分子表达，这表明这些活性在肿瘤进展过程中是必不可少的。值得注意的是，肿瘤细胞中显着下调的基因与免疫激活有关，支持先前关于肺腺癌细胞抑制免疫反应的发现。

04

AT2特征的丧失和干性的获得与肺癌进展有关

多项小鼠研究表明，AT2细胞保留了干细胞的自我更新活性，有助于推动癌症进展。与之相似，作者发现了一个AT2样细胞簇，其转录谱最初与AT2细胞非常相似，但逐渐失去了AT2细胞转录特性，同时保留了肺上皮谱系的特征。这些表达许多干细胞基因（CD44、IFI27和S100A4）的AT2样细胞在整个肺腺癌进展过程中都存在于肿瘤中（图3b）。这一观察结果表明肺腺癌进展涉及肺谱系 AT2特征的丧失和另一种去分化、茎样状态的出现。这些结果印证了癌症涉及定向上皮细胞的去分化。

作者接下来使用 RNA 荧光原位杂交 (RNA-FISH) 和间接免疫荧光染色验证上皮细胞的去分化可能在促进上皮间质转化 (EMT)中发挥作用。结果表明 FOXM1也可能是肺腺癌去分化和增殖的驱动因素，以及LUAD进展过程中EMT 标志物波形蛋白和血管生成标志物VEGF的表达增加。总之，茎样转录特征与增加的致瘤潜力相关，AT2细胞去分化为干细胞样状态，在该状态下它们启动并维持肿瘤进展。

05

肺腺癌进展中基质细胞协调肿瘤微环境

为了研究肿瘤微环境 (TME) 中的基质细胞动力学，作者检查了肺腺癌四个组织学阶段中正常和肿瘤组织的内皮细胞 (EC)、成纤维细胞、淋巴细胞和骨髓细胞的单细胞转录组。基于标记基因检测到3925个EC和五个cluster（图4a-c），接下来尝试为这些cluster中的每一个识别标记基因，并将它们分配给已知的内皮细胞类型。这些簇包括尖端样细胞、肿瘤ECs、茎样细胞、内皮祖细胞 (EPCs) 和淋巴ECs。

在所有四个组织学阶段的肿瘤组织中均观察到肿瘤ECs。早期肿瘤中的肿瘤 ECs强烈表达PLVAP、GSN和TSC22D1，这与ECs的发育和细胞命运相关。为了获得更多关于这些细胞状态的生物学见解，使用基因集富集分析 (GSEA) 来比较肿瘤和正常ECs之间的表达谱（图4c）。肿瘤EC中最富集的特征包括Myc 靶标和干扰素 (IFN) 途径。因此，这些过程可能在ECs生物学中发挥作用。内皮代表循环免疫细胞和肿瘤之间的主要界面，这可能有助于解释内皮细胞如何促进肺腺癌。

图4

已知成纤维细胞是异质的，但它们在肺腺癌进展中的异质性尚不清楚。作者检测到六组成纤维细胞，包括成纤维细胞样细胞、正常成纤维细胞、平滑肌细胞、脂肪成纤维细胞和肌成纤维细胞（图4d-f）。表达谱与成纤维细胞样细胞（A2M，PTGDS）一致，在AAH和AIS 肿瘤中可重复检测到肌成纤维细胞（ACTA2，RGS5），因此它们可能是早期肺腺癌中TME的特征。结果表明，基质细胞在肺腺癌进展过程中向组织重塑和血管生成的表型转变。

淋巴细胞在炎症、癌症免疫逃避和对免疫治疗的反应中发挥重要作用。本文中61196个淋巴细胞数据集由10个cluste组成，主要是T细胞、B细胞和NK细胞，以及其他免疫细胞类型（图4g、h）。作者观察到CD8+ T和调节性 T (Treg) 细胞在肿瘤中富集，但自然杀伤细胞在肿瘤进展过程中被耗尽。作者的分析表明，在肺腺癌进展期间，淋巴细胞组成和基因表达向免疫抑制转变。

骨髓细胞在维持组织稳态方面起着关键作用，它们调节肺部炎症。作者检查了8个骨髓细胞簇的基因特征，包括粒细胞、巨噬细胞、NK 细胞和树突细胞（图 4i、j）。树突细胞主要是髓细胞，分为三个DC亚群：DC（CCL17）、活化的 DC（BIRC3、CCL22）和CD141+ DC（CPVL、CST3）。作者推测IA阶段的TMs诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤迁移、侵袭并形成免疫抑制性TME。

TME是异质的，包括重编程的免疫细胞、成纤维细胞和ECs。为了表征肺腺癌进展中的基质细胞异质性，对来自不同阶段患者的正常和肿瘤组织中的 EC（CD31）、成纤维细胞（纤连蛋白）和免疫细胞（CD45）进行了同步免疫荧光染色（图4k）。总之，肺TME中的基质细胞和免疫细胞可以预测临床结果。

小编总结

本文揭示了肺腺癌四个不同阶段的细胞和分子水平的时空变化，从多角度证明AT2细胞是肺腺癌的起源并对AT2发挥的作用进行深入分析，可谓是单细胞应用于癌症分析的范例文章。这也给我们提供了很好的思路，即揭示癌症不同阶段进展关键细胞和分子的异质性和变化。