基因组CRISPR序列及Cas酶预测

01

CRISPR简介

CRISPR也即Clustered regularly interspaced shortpalindromicrepeats（成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列），由回文重复序列repeats及其间隔序列spacer组成，是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。在CRISPR特征序列附近还有一些CRISPR-associated基因，编码一系列Cas蛋白，合称CRISPR/Cas系统。间隔序列来自于外来入侵DNA，作为识别外来入侵者身份的指纹，其在入侵DNA上对应的为原间隔序列（protospacer），作为身份识别的原间隔序列其特点为两端延伸的临近序列十分保守，称为原间隔序列临近基序（protospacer adjacentmotif，PAM）。

病毒（噬菌体）、质粒等外源DNA首次侵入细胞时，Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA，并识别出保守的PAM区域，然后将临近PAM的非保守的DNA序列作为候选的原间隔序列。随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。然后，DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中，形成了对病毒DNA的免疫“记忆”。

当外源DNA再次入侵时，CRISPR/Cas系统会根据第一次入侵形成的免疫“记忆”对外源DNA进行精确打击，这一过程分两步进行——crRNA的合成及在crRNA引导下的RNA结合与剪切，具体机制下所示：

①crRNA的生物学合成

CRISPR区域第一个重复序列上游有一段CRISPR的前导序列，该序列作为启动子来启动后续CRISPR序列的转录，转录成两种RNA，pre-CRISPR-derived RNA(pre-crRNA)和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA是仅由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA，而pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子，pre-crRNA在重复序列处被切开进而形成crRNA。

②sRNA的结合与剪切

CRISPR/Cas系统中crRNA与tracrRNA(反式激活的crRNA)形成嵌合RNA分子，即单向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)。sgRNA可以介导Cas9蛋白在与间隔序列匹配处进行切割，从而分解外源DNA。

根据功能元件的不同，CRISPR/Cas系统可以分为I类系统、II类系统和III类系统。这三类系统又可以根据其编码Cas蛋白的基因不同而分为更多的亚类。不同类型CRISPR/Cas系统完成干扰的步骤也有所不同。

02

CRISPR预测

原核生物基因组中可能多处存在CRISPR序列，其预测注释可以使用CRISPRfinder（http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/）在线分析，提交序列后会给出确定的CRISPR序列与可能的CRISPR序列，如下所示：

其中左边的为回文重复序列，右边为不同的spacer序列。

2019年CRISPRfinder推出了新版本的CRISPRCasFinder，在预测CRISPR的同时还能找出Cas酶，且可以本地运行（https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr）。软件及数据库下载地址：https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/Home/Download。

在CentOS环境下，需要预先安装以下软件：

yum (http://yum.baseurl.org/)

Vmatch version 2.3.0 (http://www.vmatch.de/download.html)

Vmatch下载安装如下所示：

wget -chttp://www.vmatch.de/distributions/vmatch-2.3.0-Linux_x86_64-64bit.tar.gz

需要将vmatch、mkvtree、vsubseqselect命令分别改为vmatch2、mkvtree2、vsubseqselect2。

EMBOSS version 5.0.0 or upper (http://emboss.sourceforge.net/)

Prodigal version 2.6.3 (https://github.com/hyattpd/Prodigal)

MacSyFinder version 1.0.5 (https://github.com/gem-pasteur/macsyfinder)

MacSyFinder下载如下所示：

wget -c https://dl.bintray.com/gem-pasteur/MacSyFinder/macsyfinder-1.0.5.tar.gz

Muscle version 3.8.31 (http://www.drive5.com/muscle)

BioPerl version 1.6.2 or upper (http://bioperl.org/)

clustalW version 2.1 (http://www.clustal.org/download/current/)

CRISPRCasFinder安装方法如下所示：

unzipCRISPRCasFinder.zip

依次安装上述的依赖软件以及依赖包，可以运行perl CRISPRCasFinder.pl -v查看缺少哪些perl模块，然后使用cpanm进行安装，例如：cpanm JSON::Parse。安装完成后即可使用主程序CRISPRCasFinder.pl。使用方法如下所示：

perl CRISPRCasFinder.pl [options] -in <filename.fasta>
-in：输入序列，fasta格式，后缀可以是.fasta、.fna、.mfa、.fa、.txt
-out：输出结果路径
-keep：保留过程文件，Prodigal/Prokka、CasFinder、rawFASTA、Properties
-html：输出HTML网页格式的结果
-so：sel392v2.so文件的路径（这个文件干么的我也不知道，在软件包中有提供）
-mSS：CRISPR-Cas系统的序列最短长度
检测CRISPR阵列：
-md：CRISPR重复序列之间允许的错配比例，默认为20
-t：截短的CRISPR重复序列允许的错配比例，默认为33.3
-mr：重复序列的最短长度，默认为23
-xr：重复序列的最长长度，默认为55
-ms：spacer的最短长度，默认为25
-xs：spacer的最长长度，默认为60
-n：不允许重复序列的错配
-pm：spacer与重复序列长度比的最小值，默认为0.6
-px：spacer与重复序列长度比的最大值，默认为2.5
-s：spacer之间相似度的最大值，默认为60
-cpuP：程序运行使用的CPU数目，默认为1
-meta：分析宏基因组序列
-gcode：密码子表，默认为大多数细菌所使用的密码子表11
-gscf：允许总结Cas-finder的文件并复制到TSV结果
-cas：使用Prokka搜寻相应的case酶基因
-ccvr：输出CRISPR-Cas临近报告，必须设置-cs
-cpuM：允许MacSyFinder使用的CPU数目，默认为1
-ccc：允许对CRISPR与Cas进行分类
-def：更严格还是更不严格，默认为SubTyping

具体使用如下所示：

perl CRISPRCasFinder.pl -so sel392v2.so -in armatimo_genomic.fna -out armatimo_crispr_cas -def General -cas -ccvr -ccc -gscf -keep -html -cpuM 11 -cpuP 11

注意，有时可能会因为内存问题中断，这时建议使用单核运行。结果文件夹如下所示：

其中CRISPRFinderProperties中为每个contigs上面预测的CRISPR，rawCas.fna为汇总的Cas基因，rawCRISPRs.fna为汇总的CRISPR序列，Visualization中为网页格式的可视化结果。

END