文献阅读：多种病理类型肾细胞癌的scRNA 测序揭示新的潜在肿瘤特异性标志物

今天一起来看一篇文献，听听故事～也学学如何讲故事（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8551404/）

背景：

肾细胞癌 (RCC) 是最常见的肾癌类型。研究 RCC 的发病机制尤为重要，因为它可以为临床治疗提供直接指导。鉴于肿瘤异质性可能反映在 mRNA 水平，对 RCC 中 mRNA 的研究可能会揭示一些潜在的肿瘤特异性标志物，尤其是单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)。

方法：

此研究针对三种病理类型的 RCC 进行了小样本的探索性研究。共收集来自三种病理类型 RCC 的共 30,263 个单细胞的转录组，具体包括肾透明细胞癌 RCC (ccRCC)、2 型 pRCC 和 chRCC。此外，也在正常肾脏上进行了 scRNA-seq。通过比较不同病理类型的 RCC 和正常肾脏在 scRNA 水平上的比较，可以很好地确定肿瘤特征。

结果：

1.鉴定并验证了针对不同病理类型 RCC 的一些新的肿瘤特异性标志物，如SPOCK1、PTGIS、REG1A、CP和SPAG4；

2.发现NDUFA4L2在 ccRCC 和 2 型 pRCC 的肿瘤细胞中均高表达。ccRCC 和 2 型 pRCC 中存在两种不同类型的内皮细胞也得到了鉴定和验证。ccRCC 中的内皮细胞可能与显著表达的成纤维细胞标志物的成纤维细胞有关，例如POSTN和COL3A1；

3.通过应用 scRNA-seq 结果，预测了不同病理类型 RCC 中药物靶标通路的激活性和对药物反应的敏感性。

详细结果

多种病理类型肾细胞癌和正常肾的单细胞转录组图谱

scRNA-seq 在 7 个不同的患者中进行，包括 4 个肿瘤样本和 4 个正常肾脏样本（肾脏 1、肾脏 2 和肾脏 3 来自之前的研究，肾脏 4 来自本研究）（图 1A）。在使用 Seurat进行 QC 后，ccRCC、2 型 pRCC 和 chRCC 共30,263 个单细胞。四个肿瘤样本合并的 UMAP如图 1B。同时，在一个正常肾脏进行的 scRNA-seq，总共 585 个单细胞。

在来自 2 型 pRCC 的总共 10,132 个细胞，它们可分为 18 种不同的细胞类型（图 1C）。标记基因看补充材料（图 S6A和 表格1)，这些细胞类型从 1 到 18 定义如图 1C。在 ccRCC 中，从两个样本中总共获得了 12,915 个单细胞，包括 21 种不同的细胞类型，详细看图 1D，标记基因在补充材料图S6B和 表格1。在 chRCC 中，总共分析了 7,216 个高质量细胞，聚类分析确定了七个不同的细胞群。根据标记基因（图 S6C和 表格1)，这些细胞可分为 chRCC 1、chRCC 2、chRCC 3、NK-T 细胞、TAM、单核细胞和 NK 细胞 (图 1E).

此外，分析的23,951 个正常肾细胞，鉴定了 9 个不同的细胞群。详细标记基因看图S6D。对应于近曲小管细胞（proximal convoluted tubule cells, proximal tubule cells,）、肾小球壁内皮细胞、近端直小管细胞、NK-T细胞、单核细胞、远曲小管细胞、集合管 (CD) 细胞和 B 细胞。

scRNA-Seq 揭示的 RCC 细胞的多样性和基因表达特征

在这项研究中，精确定义了 2 型 pRCC的分区，而且将 ccRCC 和 chRCC 分为几种不同的肿瘤细胞类型。（图 2A）。除标志基因CDKN2A、上皮来源的KRT18和KRT7外，2型pRCC还差异表达SPOCK1、PTGIS等基因（图 2B）。在 ccRCC 中，四种 ccRCC 细胞类型的基因表达存在明显差异（图 2C）。例如，ccRCC1 和 ccRCC2 高表达 ccRCC 标记CA9和NDUFA4L2，而 ccRCC3 和 ccRCC4 仅表达NDUFA4L2 (图 2C）。还发现了三种 chRCC 细胞类型中的 DEG（图 2D）。比较了三种病理性肾细胞癌的肿瘤细胞中的 DEGs（图 2E).

在 DEG 的基础上，对每种肿瘤细胞类型进行 GO 富集分析，结果表明 2 型 pRCC 的生物学过程（BP）主要集中在“细胞粘附”和“生物粘附”（图 S7A）。CcRCC1 集中在“对氧水平降低的反应”、“对氧水平的反应”和“对缺氧的反应”（图 S7B）。考虑到ccRCC的发病机制与VHL突变引起的缺氧有关，ccRCC1可能与这一过程有关。还对其他肿瘤细胞类型进行了 GO 富集分析（图 S7C- H）

比较肿瘤细胞与正常细胞平均基因表达的相关性，探索肿瘤细胞的起源。发现 chRCC3 与 CD 细胞高度相关（图 2F）。考虑到高表达SPAG4的chRCC3的特异性（图 2D)，通过IHC-P在 chRCC 组织中验证了该标记。阳性细胞聚集在 CD 细胞周围（图 2G)，这进一步支持了该假设。

一些新型肿瘤特异性基因标志物的鉴定和验证

在 2 型 pRCC 中，鉴定了五个重要的候选基因（SPOCK1、PTGIS、NDUFA4L2、C5orf46和WISP1）；它们通常在 2 型 pRCC 中高表达（图 3A）。随后，为了确认这些基因是肿瘤特异性的，它们的表达在来自正常肾脏的 scRNA-seq 数据中得到了富集。本研究和科学论文中的数据表明这五个基因的表达非常低或没有（图 S8A、B）。而在 2 型 pRCC 组织中使用 IHC-P 验证了三种肿瘤特异性基因，即SPOCK1、PTGIS和NDUFA4L2 （ 图 3B -D），并与正常肾组织中的阴性对照进行比较（图S5A- C）。有趣的是，在之前的研究中，NDUFA4L2是 ccRCC 的标志物。然而现该基因在 2 型 pRCC 中也高度表达（ 图 3D、E).

在 ccRCC 中还发现了三个特定的候选基因（REG1A、CP和FABP7 ）（图 4A）并与正常肾脏中的进行比较（图S8C，D）。然后，使用 IHC-P 验证REG1A在 ccRCC 组织中的表达，而不是在正常肾组织中的表达（ 图 4B，S4D）。且 ccRCC 组织中CP的表达高于正常肾组织（ 图 4C）。在之前的研究中，RHCG和LINC01187被确定为 chRCC 的标记基因，在本研究中，验证了之前的结果（图 4D、E, S5E , S8E, F )，这进一步增强了chRCC 数据和肿瘤细胞定义的可靠性。此外，在 chRCC 中发现了一种称为SPAG4的新型肿瘤特异性基因标记物，它在 chRCC3 中更特异地表达（ 图 4D）。通过IHC-P获得了 chRCC 组织的阳性结果（图 4F），而在正常肾组织中获得了阴性结果（图 S5F）。因此，结果确定了一些新的肿瘤特异性标志物，并验证了不同类型 RCC 中的SPOCK1、PTGIS、REG1A、CP和SPAG4。NDUFA4L2在ccRCC和2型pRCC的肿瘤细胞中均高表达。

scRNA-Seq 揭示 RCC 的系统发育和进化

应用 Monocle2来重建 ccRCC 和 chRCC 的不同肿瘤细胞亚型分化轨迹。重构了ccRCC的发展轨迹。ccRCC4几乎处于发展的起步阶段，而ccRCC3几乎处于发展轨迹的结束阶段。CCRCC1 和 ccRCC2 存在于整个轨迹中（图 5A）。对ccRCC发展最关键的前6个基因被确定为DUSP23、ERRFI1、GADD45A、GLUL、MYOCOS和S100A1（图 5C）。在 chRCC 中进行分析，表达SPAG4的 ChRCC3位于轨迹的开头，而 chRCC1 和 chRCC2 存在于整个发展轨迹中（图 5B）。还强调了影响发展轨迹的前 6 个关键基因。它们是IFITM3、IGFBP3、SOX4、SPP1、SST和TIMP1（图 5D）。通过伪时间表达模式将这些基因分为三个簇，以进一步探索在伪时间中发生变化的基因。如热图所示，在 ccRCC 和 chRCC 中，前 50 个基因作为伪时间的函数而变化，被聚集在一起（图 5E、F).

scRNA-Seq 揭示的 2 型 pRCC 中成纤维细胞（包括多个 CAF）的多样性

在本研究中，通过 scRNA-seq 在 2 型 pRCC 和 ccRCC 中发现了多个 CAF（图 6A、D）。在 2 型 pRCC 中，这些细胞可分为四种 CAF 细胞类型和一种静止成纤维细胞。静止的成纤维细胞高表达成纤维细胞标志物SFRP2和MMP2，但不表达CAF标志物ACTA2 和TAGLN (图 6B）。2 型 pRCC 中的所有 CAF 均表达TGFB1I1（图 6B)，这反映了 CAF 的外分泌表型 。CAF 2、CAF 3 和 CAF 4 表达与上皮相关的标志物，尤其是表达KRT8和KRT18（图 6B）。这些 CAF 可能是上皮间质转化 (EMT) 并保留上皮特征。因此，使用 IF 验证了 CAF 3 在 2 型 pRCC 组织中的空间位置（图 6C）。CAF 3 非常接近肿瘤细胞。

在 ccRCC 中发现了两个表达 CAF 标志物ACTA2 和TAGLN的 CAF亚群（图 6E）。CAF 1 高表达ACTA2和TAGLN，而CAF 2 特异表达SFRP2、MMP2、TGFBI和TNC。TGFBI编码转化生长因子-β，它是 CAF 的重要分泌物。因此，CAF 2 是 ccRCC 中 CAF 的分泌表型。发现了在ccRCC中特异性表达增殖因子MKI67的成纤维细胞。鉴于先前研究通过 scRNA-seq报告肝细胞癌中增殖性 T 细胞，这些细胞被命名为增殖性成纤维细胞。

发现 pRCC 的成纤维细胞亚群比 ccRCC 的更丰富。在 pRCC 中，CAF 将与 EMT 过程相关联，而在 ccRCC 中没有发现此特征。基于CAFs和肿瘤细胞的空间定位，推测这可能是由肿瘤细胞和成纤维细胞之间的相互作用引起的（图 6C）。此外，除了增殖性成纤维细胞外，ccRCC和pRCC中CAFs标记基因的表达非常相似（图 6B ).

2 型 pRCC 和 ccRCC 中的两种内皮细胞和 ccRCC 中与成纤维细胞相关的一种内皮细胞

通过 scRNA-seq 在 2 型 pRCC 和 ccRCC 中发现了两种类型的内皮细胞 (EC)。图 7A、C）。在 2 型 pRCC 中，EC 可分为两种细胞亚型，即 pEC1 和 pEC2（图 7A）。尽管两种类型的 EC 都表达经典的内皮细胞标志物，例如PECAM1、CDH5和KDR (图 7B)，在它们之间观察到显著的异质性。两种EC的异质性主要体现在内皮生长因子( VEGF )的表达上。2 型 pRCC 的内皮细胞 1 (pEC1) 特异性表达VEGFC，而 pEC2 显著表达VEGFA (图 7B）。考虑到VEGF与肿瘤进展和预后密切相关，准确分类 EC 并深入了解其潜在生物学功能可能对 RCC 的治疗非常有帮助。

在 ccRCC 中发现了一种具有成纤维细胞特征的 EC。它表示COL3A1 和POSTN (图 7D）。尽管在之前的研究中已经报道了内皮到间质向 CAF 的转变，但这些细胞不表达 CAF 的标志物（图 7D）。鉴于之前没有报道过成纤维细胞样 EC，它可能只存在于特定的肿瘤组织中，例如 ccRCC。因此，这些在ccRCC组织中表达PECAM1和POSTN或COL3A1的细胞被标记。结果表明，这种类型的 EC 表达成纤维细胞标志物确实存在于 ccRCC 中（图 7E ， F）。然后，比较肿瘤 EC 和正常肾 EC 之间的基因表达相似性。Pearson相关系数的结果表明，这些内皮细胞中的平均基因表达非常相似（图 7G）。这些细胞之间的异质性可能是由于一些基因表达的差异。

通过与正常肾脏的比较发现肿瘤免疫微环境中的一些特征

在 pRCC 和 ccRCC 中，单核细胞/巨噬细胞通过基因标记分为许多亚群（图 8A）。TAM 存在于由GPNMB、SLC40A1和MSR1定义的三种病理性肾细胞癌中。在 pRCC 中发现了三种类型的 TAM，即增殖型 TAM（Pro-TAM）、TAM 1 和 TAM 2。Pro-TAM 不仅表达 TAM 标志物，还特异表达增殖因子MKI67 （图 8A）。虽然 Pro-TAM 以前在 pRCC 中被报道过，但这种细胞在 2 型 pRCC 中的转录组学特征尚未见报道。此外，在 ccRCC 或 chRCC 中未发现 Pro-TAM（图 8A)，这可能是 pRCC 肿瘤免疫微环境的特征。

T细胞是具有肿瘤杀伤特性的免疫细胞，尤其是CD8 + T细胞，参与pRCC和ccRCC（图 1C , D）。在 ccRCC 中，T 细胞包括 CD8 + T 细胞 1、CD8 + T 细胞 2 和 CD4 + T 细胞（图 8D）。在 pRCC 中，T 细胞可分为 3 种细胞类型，即 CD8 + T 细胞 1、CD8 + T 细胞 2 和增殖性 T 细胞（图 1C）。根据基因表达的特点，发现了一类特异表达MKI67的T细胞，并将其视为增殖性T细胞（图 8B）。在这里，发现增殖 T 细胞浸润是 ccRCC 免疫微环境的一个特征，这与之前的研究一致。在 pRCC 中对所有 T 细胞进行伪时间轨迹分析，以进一步了解这种细胞类型的增殖特征。结果也验证了增殖性T细胞几乎处于发育轨迹开始阶段的特征（图 8C).

比较了三种病理类型RCC与正常肾组织中单核细胞/巨噬细胞基因表达的相关性。RCC中的单核细胞/巨噬细胞与其基因表达具有非常高的相关性（图 8E）。然而，RCC与正常肾脏中单核细胞/巨噬细胞基因表达的相关性略低于T细胞（图 8E ， F）。T 细胞或 NK-T 细胞没有显著表现出这一特征，它们之间的相关性几乎大于 0.9（图 8F）。这一发现可能表明 T 细胞在 RCC 和正常肾脏中的基因表达略有差异。

scRNA-Seq 与 GWAS 结果和 TCGA 数据的整合确定了可能影响预后的特定 chRCC 细胞类型

作者整理了所有与 RCC 相关的易感基因位点（均来自 GWAS 目录）。进行过滤后，选择p值小于1×10 -8的易感基因位点并与相应基因匹配。这些易感基因富集到 RCC 的每种细胞类型中。与 RCC 相关的 17 个基因中有 12 个在 ccRCC 3 中表达（图 S9B，群 15）。在 2 型 pRCC 和 chRCC 中，没有观察到易感基因在一种细胞类型中的聚集（图 S9A 、C）。

然后，将 chRCC 数据应用于 TCGA 预测三个 chRCC 亚群的预后。chRCC 1 中的 6 个 DEG 与预后相关（图 S9D），而 chRCC 2 中只有两个与预后相关（图 S9E）。此外，chRCC 3 中 17 个 DEG 中的 14 个与预后不良相关（表 S9）。因此，不同肿瘤细胞类型的组成可能会影响预后。chRCC 3 可能是导致 chRCC 预后不良的细胞类型。

肿瘤细胞与 CAF 和免疫细胞中的配体受体的相互作用发现了 2 型 pRCC 和 CAF 之间密切关系的特征

作者计算肿瘤细胞和 CAF/免疫细胞之间的配体-受体相互作用评分。在 2 型 pRCC 中，肿瘤细胞和 CAF 之间的细胞间相互作用非常接近。共有 118 个配体-受体相互作用评分大于 1（图 9A）。特别是，这些配体-受体（ITGB1-COL1A2、ITGB1-COL1A1、ITGB1-COL3A1、CD63-TIMP1 和 ITGB1-FN1）在 2 型 pRCC 和 CAF 之间相互作用更密切（图 9A）。使用免疫染色对 CAF 进行可视化，以了解 CAF 在 2 型 pRCC 中的空间位置。它们位于肿瘤细胞周围（图 9D）。CAF 的空间位置可能有助于它们与肿瘤细胞的相互作用。有趣的是，ITGB1上调可以促进胃肠道肿瘤的进展和侵袭，例如肝细胞癌和胃癌。并且ITGB1上调促进肾细胞癌的发展和转移。因此，CAFs 与 pRCC 的相互作用可能促进 pRCC 的进展和侵袭。

然后，分析了四种不同 ccRCC 细胞类型与 CAF 之间的配体-受体相互作用（图 9B, S10A )。ccRCC 3 和 CAFs 高度相关，尤其是 CAF 2 ( 图 9B). 同时，计算了 RCC 和免疫细胞之间的细胞间相互作用。在 2 型 pRCC 中，2 型 pRCC 和 TAM 1 之间的细胞间相互作用强烈相关（图 9C）。然而，在 ccRCC 和 chRCC 中，肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用显着降低（图 S10B 、C）。

通过 scRNA-Seq 结果预测药物靶标途径和对药物反应的敏感性

使用涉及药物靶标通路对单细胞计算 GSVA 评分，评估了 2 型 pRCC、ccRCC 和 chRCC 中药物靶标特征的相对激活状态。本次分析共纳入 12 种常见的药物靶点通路。大多数通路在三种病理类型中受到明显调控，导致药物敏感性差异（图 9E）。2 型 pRCC 和 ccRCC 在 RCC 经典途径中比 chRCC 更活跃，例如 EGFR 和 VEGFR 途径，而 chRCC 在 MTOR 途径中更活跃（图 7E）。随后，预测了 2 型 pRCC、ccRCC 和 chRCC 中 13 种靶向药物的敏感性。基于岭回归模型预测药物敏感性信号通路激活的效率，并将公共基因表达谱和药物敏感性数据用作训练集。在药物敏感性预测后，靶向药物（阿法替尼、阿西替尼、克唑替尼、厄洛替尼和吉非替尼）在 ccRCC 中的敏感性优于其他类型的 RCC（图 9F）。2 型 pRCC 对卡博替尼、达沙替尼、福瑞替尼、帕唑帕尼、司美替尼、索拉非尼、舒尼替尼和替西罗莫司等靶向药物更敏感，但 chRCC 对这 13 种靶向药物几乎都耐药（图 9F).

总结

亮点：

• 提供了 RCC 的全面、单细胞分辨率、多病理转录组图谱；
• 发现许多新的RCC肿瘤标志物，可能对scRNA-seq诊断RCC具有潜在价值
• 使用 scRNA-seq 鉴定了一些新的细胞类型，例如增殖性成纤维细胞和成纤维细胞相关的 EC
• 正常肾脏和 RCC 的比较分析增强了对肿瘤免疫微环境的理解

重要结论：

• NDUFA4L2在之前的研究中被认为是 ccRCC 的特异性标志物，在 2 型 pRCC 中也高度表达
• 之前研究通过TCGA 的RNA 测序数据报告了 chRCC 的肿瘤特异性标志物（RHCG和LINC01187 ），在本研究中使用 scRNA-seq 获得了类似的结果和新的肿瘤特异性标志物 ( SPAG4 )
• 可能与预后不良相关的肿瘤细胞类型，如chRCC 3。chRCC 3 中的 DEG 分析表明，这些 DEG 中的大多数导致预后不良
• 在 2 型 pRCC 和 ccRCC 中发现了一些 CAF 亚群。在 2 型 pRCC 中，大多数 CAFs 表达上皮标志物（KRT8和KRT18），如 CAF 2、CAF 3 和 CAF 4
• 先前的一项研究将CLEC14A确定为肿瘤 EC 的标志物，这一结果在本研究中也得到了验证。CLEC14A在所有捕获的肿瘤 EC 类型中均高表达，EC在 2 型 pRCC 中也表达VEGFA或VEGFC

局限：

scRNA-seq 的样本量很小，很难比较更多患有 2 型 pRCC 和 chRCC 的患者之间的肿瘤异质性