之前我们在质控
(QC
)篇介绍了Normalization
的重要性。😘
scRNAseq
是一个高维度的数据,相对比较复杂,不同细胞
,不同平台
,相差较多,所以library
大小差异较大,我们需要做一个Normalization
,常用方法包括:👇
UQ
, SF
, CPM
, RPKM
, FPKM
, TPM
。🤒
Note!
如果你使用的是Cufflinks
或者RSEM
进行定量。
恭喜你, 不需要normalization
,因为这类方法已经考虑到的library
大小不同的问题了。
rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(SingleCellExperiment)
library(scater)
library(scran)
library(scRNA.seq.funcs)
这里我们用一下之前介绍的counts
文件和annotation
文件,然后通过SingleCellExperiment
创建SingleCellExperiment
格式的文件,并且经过初步过滤
,ID转换
等。
load("umi_umiqc.Rdata")
umi.qc
这里我们用取过log
后的raw_counts
进行PCA
绘图。
umi.qc <- runPCA(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw")
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
这里我们先做一个CPM
,然后取log
,再做一下PCA
。聚类明显要好一些了!😂
logcounts(umi.qc) <- log2(calculateCPM(umi.qc) + 1)
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")
这里我们引入一个新的可视化方式,叫relative log expression (RLE) plots
。
先对raw_counts
做一个RLE plots
吧, 这里可以看出有明显批次效应
。
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw",colour_by = "batch") + ggtitle("RLE plot for logcounts_raw")
再看一下CPM
后的结果吧,非常明显!🥳
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch") + ggtitle("RLE plot for log2(CPM) counts")
基于CPM
的Normalization
方法,或者其他类似的方法,有一个前提,就是假设所有细胞含有相似数量的RNA
,但这有时候是不对的。🤒
这里我们介绍一下scran
包,通过反卷积
的方法进行Normalization
。🤗
qclust <- quickCluster(umi.qc, min.size = 30)
table(qclust)
接着我们来计算一下sizeFactor
,用于后面的Normalization
。🧐
umi.qc <- computeSumFactors(umi.qc, clusters = qclust)
开始log
和Normalization
。🤩
umi.qc <- logNormCounts(umi.qc)
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch",size_by = "detected", shape_by = "individual")
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch")
如果你已经做过Normalization
,再做一次的话,这个size factors
会是负数,严重影响你的结果。🫠
我们可以check一下。✌️
summary(sizeFactors(umi.qc))
这里再介绍一个scRNA.seq.funcs
包的Down_Sample_Matrix
函数。
采用了downsample
,降采样
的方法,具体概念不介绍了,大家自行google
。
logcounts(umi.qc) <- log2(Down_Sample_Matrix(counts(umi.qc)) + 1)
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc,colour_by = "batch",size_by = "detected", shape_by = "individual")
plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch")
最后祝大家早日不卷!~