详解磷脂脂肪酸分析 Phospholipid Fatty Acid Analysis(PLFA)

作者：周通

审核：Listenlii

背景

上周组会讲了Nature Microbiology上的一篇文章[1]。

文章主要对一块实验土壤做了温度、降水、剪草等处理，测了细菌、真菌、原生生物的多样性以及生物和非生物的环境因子，最后发现增温通过影响土壤湿度改变了细菌的多样性，进而影响了原生生物。最后与宏观生态进行了关联，升华到了全球变暖问题如何一步步导致了微生物的多样性降低。

其中说有益真菌AMF类群，在增温状态下，多样性降低，并且通过PLFA结果也验证了这一现象。

PLFA是什么？本文一起来通过公众号科研和文献溯源的方法一步步了解这个技术。

这篇文章方法部分概述了PLFA方法：根据以前描述的改良的Bligh-Dyer方法[2]，从土壤样品中提取脂类。

简而言之，土壤样品被冷冻干燥并过筛，以去除任何岩石或大的碎片。然后将每个冻干的土壤样品（2克）放在2:1:0.8的甲醇、氯仿和K2HPO4缓冲液中。

收集氯仿相，将磷脂从中性脂质和乙二醇中分离出来。通过硅酸色谱法从中性脂质和糖脂中分离出来，随后进行皂化并甲基化为脂肪酸甲酯。

所得的脂肪酸甲酯用气相色谱法进行分离和鉴定，峰值反应转化为摩尔反应。与MIDI Sherlock微生物鉴定系统相匹配，使用Agilent Chemstation 软件根据峰值反应解析微生物组，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、放线菌、厌氧菌、普通真菌和AMF。

土壤的总细菌生物量是由所有的PLFA计算出来的。计算出所有细菌群体的总PLFA，即革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、放线菌、厌氧菌和普通真菌的生物量之和。

真菌的总生物量被计算为普通真菌和AMF的生物量之和。

查阅了一系列公众号，发现近年这一技术的介绍相对较少，可能是太久远了。

先不管现在这个技术是否还有存在的必要，但NM这篇文章至少是用这个技术作为组学方法的验证方法了。

这篇文章是13年之前开始的实验，那个时候这个技术应该还没有落伍。

一些问题

1. 组学盛行的今天，这个技术是否还有其独特的价值；
2. 现有微生物组书籍中是否有专门小节系统介绍这一技术；
3. 使用过这一技术的人对其有何评价。

一些研究

2021 SBB：外源有机碳的输入量和土壤有机质含量之间的相互作用是否决定了其降解[3]

使用真菌标记物PLFA检测不同土壤中真菌的丰度，探讨其与外源有机物（exogenous organic matter，EOM）的关系。

中文解读：

土壤外源有机物分解丨SOIL BIOL BIOCHEM：外源有机碳的输入量和土壤有机质含量之间的相互作用是否决定了其降解

2017 SR：土壤细菌定量方法结合相对丰度分析揭示种群的真实变化[4]

比较了PLFA及三磷酸腺苷 (ATP)、流式细胞计数 (FCM)、定量PCR (qPCR)、微生物量碳定量 (MBC) 等微生物绝对定量方法，相较于扩增子测序方法具有不可替代的作用。

这个结论与2021年Verónica Lloréns-Rico发在Nature communications上的结论一致[5]，但是2021那篇文章只使用了两种绝对定量方法，故事侧重于定量与测序深度矫正。

其中对于PLFA方法进行了详细描述：

采用改良的Bligh-Dyer方法进行脂肪酸提取[6]。2g新鲜的土壤样品，加入甲醇-氯仿-磷酸缓冲液(2:1:0.8) 混合溶液进行萃取。土壤提取液进行过滤后，收集氯仿阶段。磷脂通过硅酸色谱从糖脂和中性脂质中分离，随后皂化与甲基化后转化为脂肪酸甲酯(FAME)。随后，FAME在毛细管气相色谱中分离，并利用气相色谱/质谱联用进行鉴定。所有的PLFA操作均在中国科学院南京土壤研究所进行。最终共有109种不同的PLFA被检测和识别。特定的PLFA(15:0, i16:0, 17:0, i15:0, a15:0, i17:0, a17:0, cy17:0, 16: 1w5, 16: lw7t,16:lw9, 18:lw7, and cy19:0)，通常作为细菌的生物标记。通过将所有细菌PLFA生物标记物的绝对含量进行加和，计算土壤中细菌的绝对生物量。利用换算系数来估算土壤细菌的个体数量。

中文解读：

土壤细菌定量方法结合相对丰度分析揭示种群的真实变化

2012 ASE：土壤高通量PLFA分析方法[2]

方法部分分步骤详细描述了PLFA分析方法。

2006 SBB：微生物群落对新增碳基质的利用对长期碳输入操纵的反应[6]

解释了同位素标记的特异性PLFA分析方法。

1959 CJBP：快速提取纯化总脂质的方法[7]

所有方法最终指向这一篇历史文献，都是基于此方法进行的调整优化。

答案

之前问题的答案已经有了：

1. 组学盛行的今天，这个技术是否还有其独特的价值： 是。绝对定量方法的一种。
2. 现有微生物组书籍中是否有专门小节系统介绍这一技术： --《微生物组学实验手册》未涉及。 --《Gut Microbiome-Related Diseases and Therapies》未涉及。 --《Microbiomes》未涉及。 --《The Marine Microbiomes》12.2.4有简单提及。 --《Gut Microbiota, Immunity, and Health in Production Animals》未涉及。
3. 使用过这一技术的人对其有何评价： （来自Listenlii的快乐磕盐群1相关讨论） --我看到的NEE的话 也有用PLFA 氯仿熏蒸 qpcr 这三个方法比较的。 --PLFA古菌不太行。 --SBB文章用PLFA挺多的，其他期刊倒是少见。

--PLFA准么? --PLFA不能分细菌，古菌吧？ --PLFA只能定量这些：

参考文献

[1] Wu, L., Zhang, Y., Guo, X. et al. Reduction of microbial diversity in grassland soil is driven by long-term climate warming. Nature Microbiology 7, 1054–1062 (2022).

[2] Buyer, J. S. & Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils.Applied Soil Ecology 61, 127–130 (2012).

[3] Mendoza, O., De Neve, S., Deroo, H., Li, H., & Sleutel, S. Do interactions between application rate and native soil organic matter content determine the degradation of exogenous organic carbon?. Soil Biology and Biochemistry 164, 108473 (2022).

[4] Zhang, Z., Qu, Y., Li, S. et al. Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa. Scientific Reports 7, 4837 (2017).

[5] Lloréns-Rico, V., Vieira-Silva, S., Gonçalves, P.J. et al. Benchmarking microbiome transformations favors experimental quantitative approaches to address compositionality and sampling depth biases. Nature Communications 12, 3562 (2021).

[6] Brant, J. B., Sulzman, E. W. & Myrold, D. D. Microbial community utilization of added carbon substrates in response to long-term carbon input manipulation.Soil Biology and Biochemistry 38, 2219–2232 (2006).

[7] Bligh, E. G., & Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology 37(8), 911-917 (1959)