单基因肿瘤生信分析依然可以发表6分+

导语

MLLT11在神经胶质瘤中与肿瘤微环境和免疫细胞浸润的关系仍然未知。

背景介绍

小编今天为大家带来一篇单基因单肿瘤的生信分析文章，发表在Front. Oncol上，影响因子6分+，题目为Identification of the novel prognostic biomarker, MLLT11, reveals its relationship with immune checkpoint markers in glioma。

研究设计

数据介绍

从TCGA、CGGA和GEO数据库中的低级别胶质瘤（LGG）和高级别胶质瘤(GBM)样本中收集表达谱数据。TCGA包括697个样本，CGGA1包括mRNAseq_693、mRNAseq_325和CGGA_array数据集共1319个样本。从GEO的GSE43378，GSE16011，GSE74187和GSE83300数据集中收集了444个样本。GTEx数据库中提取105个正常大脑皮层样本进行差异表达比较。此外，作者从中南大学湘雅医院神经外科收集了创伤后正常脑组织（n=9）和胶质瘤样本（n=27），分别包括9例2级、3级和4级胶质瘤。

结果解析

01

MLLT11在胶质瘤中的表达和临床特征

首先比较了TCGA和GTEx数据集中LGG、GBM和正常脑皮层的MLLT11表达，发现正常脑与WHO2级和WHO3级胶质瘤之间没有显著差异，但MLLT11在GBM中的表达是四个组织中最低的。

MLLT11在胶质瘤组织学中的表达表明，GBM的表达最低，其次是星形细胞瘤，正常脑，少星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤之间没有差异（图1A，B）。根据中位年龄，患者分为高年龄亚组和低年龄亚组，在TCGA数据集中，高年龄亚组和低年龄亚组之间的MLLT11表达存在显著差异（图1C）。同时，除GBM外，年轻组和老年组之间的LGG表达没有显著差异（图1D）。在CGGA数据集中也可以看到相同的结果。

图1

此外，将MLLT11表达差异在高年龄亚组和低年龄亚组的不同WHO病理分级中进行分析。结果表明，在高龄和低龄组中，随着肿瘤分级的增加，MLLT11的表达水平均有明显的下降趋势。在CGGA数据集和TCGA数据集中，男性和女性在不同WHO病理等级中的MLLT11表达没有显著差异。

IDH突变、1p/19q共缺失、MGMT甲基化状态等一系列分子标志物与胶质瘤恶性肿瘤及患者预后有关。作者发现，在TCGA数据集中，1p19q共缺失状态和非共缺失状态之间的MLLT11表达存在显著差异。与1p19q非共缺失相比，MLLT11在1p19q共缺失中的表达更高（图1E），在LGG中也发现相同的结果。在非共缺失的患者中，MLLT11的表达随着肿瘤分级的增加而逐渐降低（图1F）。MLLT11在IDH突变和非突变之间的表达水平存在显著差异，这在CGGA和TCGA数据集中得到了验证。MLLT11在IDH突变亚型中的表达与正常大脑相似，明显高于IDH野生型胶质瘤，在GBM中差异更明显（图1G-J）。与单独使用IDH突变或1p/19q共缺失相比，MLLT11联合IDH突变联合1p/19q共缺失的表达最高（图1K），表明MLLT11表达的预后价值与已知的IDH突变联合1p/19q共缺失一致。

作者采用qPCR、Western Blot和免疫组化染色检测本机构不同等级胶质瘤样品中（n = 27）和正常脑组织（n = 9）MLLT11的mRNA转录水平和蛋白表达。qPCR结果显示，MLLT11在肿瘤组织中的表达水平显著低于正常脑组织（p < 0.05），但不同等级的胶质瘤间差异无统计学意义（图1L）。此外，蛋白质印迹和IHC结果证实，与GBM组织相比，MLLT11在正常脑组织和LGG中的表达更高（图1M，N）。

综上，MLLT11表达水平较高的胶质瘤患者在胶质瘤患者中获得了良好的结果。MLLT11在GBM中显著降低，可能在胶质瘤的侵袭性过程中发挥重要作用。

02

MLLT11显示胶质瘤的亚型偏好

基于TCGA，GBM可分为4个亚型，即经典（TCGA-CL）、间充质（TCGA-ME）、前神经（TCGA-PN）和神经（TCGA-NE），其中PN亚型预后相对较好，但CL和ME亚型更具侵袭性，预后较差。作者在TCGA和GTEx数据集中探索了LGG、GBM样本和正常组织中的MLLT11表达，发现MLLT11表达增加与TCGA和CGGA数据集中的NE和PN亚型相关（图2A–D）。

图2

作者进一步从单细胞维度进一步分析了MLLT11在胶质瘤中的表达。从四个胶质瘤样本中鉴定出七个细胞簇，主要包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞（OPC）、肿瘤细胞、神经元、血管内皮细胞和免疫细胞（图2E）。MLLT11的表达主要集中在肿瘤细胞，免疫细胞和OPCs中（图2F）。scRNA-seq聚类分析显示，MLLT11主要在NPC样细胞中表达，与其他三个细胞亚型簇显着不同（图2G-I）。综上，MLLT11主要在TCGA-NE和TCGA-PN中上调，应将MLLT11作为GBM亚型的标志物。

03

MLLT11表达与患者预后

在TCGA，CGGA和GEO的八个数据集中评估了MLLT11的预后价值。将患者分为低表达亚组和高表达亚组，并使用对数秩检验分析进行生存分析。结果显示，在TCGA、CGGA_array和CGGA_RNAseq_325数据集中，MLLT11表达较高的患者的预后明显优于低表达亚组（图3A-C）。在GSE43378数据集中，尽管MLLT11高表达组和低表达组之间的生存分析没有明显的统计学意义，但它们之间仍然存在相似的趋势（p = 0.16）（图3D）。此外，在GBM患者中，发现MLLT11高表达的患者在CGGA_RNAseq_693数据集，GSE16011数据集，GSE74187数据集和GSE83300数据集（图3E-H）中表现出更好的预后。

图3

应用多因素Cox回归分析研究特征的预后能力，结果显示，MLLT11的表达是调整年龄、性别、IDH、MGMT启动子、端粒酶逆转录酶（TERT）启动子和1p19q共缺失状态后胶质瘤患者的独立预后生物标志物（图3I)。此外，采用TCGA数据集中的ROC曲线分析来综合评估模型的敏感性和特异性。MLLT11的曲线下面积（AUC）在胶质瘤队列中为68%（图3J）。

04

功能富集

作者分析了TCGA中MLLT11表达低和高的组之间的301个差异表达基因（230个上调和71个下调）（图4A）。KEGG富集分析表明，MLLT11上调基因 参与与神经活性配体-受体相互作用、突触囊泡周期、cAMP 信号通路、谷氨酸能突触和 GABA 能突触相关的途径（图4B），而MLLT11下调基因参与与补体和凝血级联以及花生四烯酸代谢相关的途径（图4C).。

同样，在CGGA_325数据集和CGGA_array数据集中，MLLT11上调基因也主要富集在GABA能突触、逆行内源性大麻素信号传导、突触囊泡周期和谷氨酸能突触中。MLLT11下调基因主要富集于细胞外基质（ECM-受体相互作用、蛋白质消化和吸收以及补体和凝血级联的途径。在CGGA数据集中也发现了相同的结果。综上，MLLT11可能通过ECM组织影响胶质瘤微环境，并可能促进突触信息影响胶质瘤的进展。

图4

05

主成成分分析

作者进行了PCA分析，以基于MLLT11的表达来研究低表达亚组和高表达亚组之间的代谢状态差异。PCA结果显示，在TCGA数据集中，PCA1（Dim1）和PCA2（Dim2）对总方差的贡献分别占55.5%和15.1%（图5A）。同样，在CGGA数据集中，Dim1和Dim2分别占总方差的66.4%和7%（图5B）。

此外，对差异表达进行了KEGG富集分析，以探索TCGA和CGGA中MLLT11低表达和高表达亚组之间的代谢状态差异。在低表达亚组中，差异表达基因参与多种肿瘤和免疫相关途径，例如白细胞经内皮迁移，细胞因子-细胞因子受体相互作用，用于IgA产生的肠道免疫网络，移植物抗宿主病，原发性免疫缺陷，自身免疫性甲状腺疾病，糖胺聚糖降解，溶酶体，ECM-受体相互作用和谷胱甘肽代谢（图5C，D）。在MLLT11低表达亚组中，泛素介导的蛋白水解、牛磺酸和次牛磺酸代谢、WNT信号通路、哺乳动物/雷帕霉素（mTOR）信号通路的哺乳动物/机制靶标，以及磷脂酰肌醇信号传导系统富集。这些结果表明胶质瘤的侵袭性与异常的免疫状态有关。

图5

06

MLLT11与免疫细胞和检查点

采用CIBERSORT算法探讨了MLLT11表达与22个免疫细胞免疫浸润水平之间的相关性，包括B细胞、T细胞、自然杀伤（NK）细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。Pearson相关分析用于鉴定CGGA和TCGA测序数据集中与MLLT11表达密切相关的免疫细胞。

TCGA数据集结果表明，MLLT11的表达与幼稚CD4 T细胞和CD8 T细胞的浸润水平呈正相关，与巨噬细胞，尤其是M2巨噬细胞的浸润水平呈负相关（图6A，B）。在CGGA阵列和CGGA 325数据集中也发现了类似的结果。

图6

通过qPCR，IHC和蛋白质印迹，在不同病理级别的胶质瘤组织中，发现随着肿瘤分级的增加，M2型巨噬细胞特异性标志物的表达水平显著增加，包括CD206，CD163，ARG1，CD115和IL-10（图7）。在肿瘤进展过程中，随着MLLT11表达水平的降低和免疫浸润水平的升高，生成的M2免疫细胞可能会促进侵袭过程。

图7

小编总结

本文是一篇分析的很全面的单基因生信分析文章。

作者首先调查了MLLT11在肿瘤和正常样本的差异表达，正常脑组织中高表达，并随着肿瘤等级的增加而降低。在分析年龄效应时，年轻亚组和老年亚组之间MLLT11的表达存在显著的统计学差异。进一步的肿瘤分级分析表明，LGG中年轻亚组和老年亚组之间MLLT11的表达无统计学意义差异，但在GBM中，老年亚组MLLT11的表达明显低于年轻亚组。基于这些证据，考虑到GBM的发病率常在老年患者中，作者推测MLLT11可能是一种促进分化和肿瘤抑制作用的基因，MLLT11可能在胶质瘤的进展中起关键作用。

此外，1p19q共缺失和IDH突变状态对预测胶质瘤预后具有重要意义。1p19q共缺失和IDH突变提示预后更好。与单独存在1p19q共缺失和IDH突变的患者相比，MLLT11在两者的组合中表达更高，表明MLLT11的表达模式在预测胶质瘤患者预后中的作用与1p19q缺失和IDH突变相似。

作者进一步分析了MLLT11在TCGA和CGGA的RNA-seq数据中的表达。MLLT11主要在肿瘤细胞、免疫细胞和OPC簇中表达。scRNA-seq分析表明，NPC样亚型的MLLT11表达水平显著高于其他3种亚型，即AC样、OPC样和MES样。本体PN亚型对应于NPC样细胞亚型，两种亚型均在自己的分类中表示预后更好。基于来自TCGA和CGGA数据集的独立数据集的生存分析发现，高水平的MLLT11表达往往可以预测更好的结果。这些结果表明，MLLT11对胶质瘤预后具有重要的预测价值。