佳作推荐 | 王璋及合作者揭示慢性阻塞性肺病呼吸道菌群-宿主互作机制

8月22日，Nature Microbiology (IF2021=30.964) 在线发表了华南师范大学生态科学研究所王璋研究员团队的科研成果：Multi-omics analyses of airway host-microbe interactions in chronic obstructive pulmonary disease identify potentialtherapeutic interventions。该论文通过对慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺、COPD)患者进行深度多组学分析，结合体内外功能实验，揭示了慢阻肺呼吸道微生物。

该研究由华南师范大学、深圳市人民医院、南方医科大学、广州医科大学共同合作完成。王璋（华南师范大学）、陈荣昌（深圳市人民医院）、周宏伟（南方医科大学）为共同通讯作者。澳大利亚新南威尔士大学Emad El-Omar教授、美国加州大学Jack Gilbert教授，美国罗格斯大学Martin Blaser教授、加拿大McMaster大学Martin Stampfli教授、华南师范大学生命科学学院教授、美格基因创始人束文圣教授参与该研究并对数据分析、论文撰写与修改提供指导。该研究得到了国家重点领域研发计划（2017YFC1310600）、国家自然科学基金（31970112、32170109）、广东省自然科学基金（2019A1515011395）、深圳市科创委项目（KCXFZ202002011008256）、以及广东省医学科研基金项目（C2019001）的支持。

热烈祝贺王璋研究员及其团队取得丰硕科研成果，论文解读如下：

慢性阻塞性肺疾病中气道宿主-微生物相互作用的多组学分析确定了潜在的治疗干预措施

期刊：Nature Microbiology

时间：2022-08-22

影响因子：30.964

DOI：https://doi.org/10.1038/s41564-022-01196-8

- 摘要 -

呼吸道微生物组在慢阻肺中的作用机制尚未清楚。通过对我国广州和深圳两地99名慢阻肺患者和36名健康个体痰液宏基因组、代谢组、宿主转录组和蛋白质组进行分析，我们绘制了慢阻肺气道微生物组-宿主互作图谱。通过序贯中介效应分析，整合多组学数据，评估微生物组与慢阻肺主要炎症内型（嗜中性粒细胞或嗜酸性细胞炎症）的联系。利用微生物遗传信息和已知的“代谢物-宿主基因”互作信息，提出了潜在的“微生物-代谢物-宿主”互作假说。其中，嗜中性粒细胞炎症慢阻肺中关键假说之一是气道乳杆菌驱动的色氨酸代谢发生改变，这一变化与吲哚-3-乙酸（IAA）减少有关，IAA的减少通过宿主白细胞介素-22（IL-22）信号通路来潜在影响气道炎症与细胞凋亡。体内和体外研究表明，气道微生物组来源的IAA通过IL-22介导的巨噬-上皮互作减轻气道炎症、肺气肿和肺功能下降。通过鼻内接种两株气道乳杆菌，可补充气道IAA水平并重现其对小鼠的保护作用。该研究为靶向气道微生物-宿主互作的治疗手段提供理论依据。

- 引言 -

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺，COPD）居世界死亡原因第四位，其特征是不可逆的肺功能下降，由气道炎症、肺气肿和肺泡损坏导致。慢阻肺具有异质性，不同的临床表型背后对应不同的病理生理模式（内型，Endotype）。嗜中性粒细胞炎症和嗜酸性细胞炎症是慢阻肺的两种主要炎症内型，其具有不同的发病机制、气道微生物组特征，并对应不同的治疗方案。众多证据表明，气道微生物组与慢阻肺表型和内型相关，气道微生态失衡可能导致气道炎症的发生。然而，我们对气道微生物组功能特性、代谢活动和与宿主免疫系统的互作缺乏了解，对气道微生物组参与疾病发生发展的机制认知甚少。本团队近期通过多组学荟萃分析预测了气道微生物组与宿主相互作用影响慢阻肺发生发展可能方式（Wang et al. ISME J, 2020）。在本研究中，我们进一步围绕“微生物-代谢-宿主”轴，对来自广东省两个临床中心的慢阻肺患者和健康人群的进行了深入的多组学分析。我们对每个痰液样本宏基因组测序深度超过2亿reads，以保证在较高宿主核酸比例情况下足量的微生物覆盖率。同时测定了痰液代谢组和宿主转录组，并检测了部分人群痰液和血清中280种炎症相关蛋白。我们提出了一种识别与嗜中性粒细胞或嗜酸性细胞炎症相关慢阻肺“微生物-代谢-宿主”互作的分析策略，并通过体内外功能实验验证假设，以阐明气道微生物组在慢阻肺中的作用。

- 结果 -

慢阻肺痰液宏基因组

COPD sputum metagenomes

我们收集了广州与深圳两地共99例慢阻肺患者和36例健康对照的诱导痰进行多组学分析。在广州和深圳队列中，均观察到慢阻肺患者与对照组的菌群存在明显差异（图1a）。在慢阻肺患者中卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的相对丰度增加最为显著，中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）的相对丰度减少最为显著（图1b）。KEGG富集分析发现细菌运输系统和氨基酸生物合成模块在慢阻肺患者中富集，而能量代谢和氨基酸代谢模块在健康人中富集。不同的模块组分别与痰中性粒细胞或嗜酸性粒细胞百分比相关，提示内型特异性的宏基因组特征（图1c）。基于序列组装与分箱，我们重建了气道宏基因组物种（MGS），其中384个MGS包括所有主要门水平的66个种及40属（图1d），占总系统发育多样性的37.4%。

图1. 慢阻肺患者和健康对照组的气道宏基因组图谱

（a）慢阻肺患者和健康组在菌群分类和功能上具有差异，且该差异独立于广州或深圳数据集；（b）慢阻肺患者和健康组之间31个差异丰富物种箱线图；（c）在广州和深圳数据集中，慢阻肺患者和健康组之间存在差异KEGG模块；（d）符合中等质量及以上的384个MGS，其完整度、污染度、及在慢阻肺患者与健康对照中的变化幅度。

慢阻肺气道代谢组、宿主转录组和蛋白质组

COPD sputum metabolomes, host transcriptomes and proteomes

对痰液样本进行非靶向代谢组学检测发现了1671个代谢分子，部分在慢阻肺患者与健康个体之间差异显著（图2a）。通过WGCNA分析，将所有代谢物组合并成128个共有丰度模块，其中COPD组分别有37个和24个模块显著上调或下调（前十个模块如图2b所示）。在宿主转录组中，19142个基因被整合至497个共丰度模块。其中126个模块在慢阻肺患者和对照组之间差异表达，并可富集到生物途径（前十个模块如图2c所示）。通过对280种炎症相关蛋白进行检测，确定了慢阻肺患者和对照组之间差异表达的60种痰液蛋白和38种血清蛋白（图2d）。

图2. 慢阻肺患者和健康对照组的气道代谢组、宿主转录组和蛋白质组图谱

（a）主成分分析表明，慢阻肺患者和健康对照组在代谢组、宿主转录组、痰液和血清蛋白表达显著差异；（b）痰液代谢组差异共丰度模块（前10个）；（c）宿主转录组差异共丰度模块（前10个）；（d）痰液和血清差异蛋白。

多组学联合分析

Integrated multi-omics for COPD microbe–host interactions

假设气道菌群产生或消耗代谢分子，其对宿主基因表达的影响在嗜中性粒细胞和嗜酸性慢阻肺中存在差异。为了验证这一假设，我们沿着“菌群-代谢-宿主”轴的多组学模块进行了序贯中介效应分析，以评估微生物组（MetaG）依次通过代谢组（MetaB）、宿主转录组（HostT）、和蛋白质组（HostP）对宿主表型（嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞炎症）的影响。我们发现，相对于嗜酸性慢阻肺，嗜中性慢阻肺具有更强的“微生物-宿主”关联效应。基于现有数据库（KEGG、MetaCyc、STITCH等），我们提取“微生物-代谢物”及“代谢物-宿主”互作的生物学信息，对具有显著中介效应的多组学模块进行功能注释。最终确定了620和134条分别与嗜中性与嗜酸性慢阻肺相关的“微生物组-代谢组-宿主转录组”互作链条，其中146和39条进一步与痰或血差异蛋白表达关联。

为评估多组学模块关联在各自炎症环境中的重要性，我们使用每组关联的多组学模块进行随机森林回归，预测痰中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的百分比。对于中性粒细胞炎症，我们发现了一条与色氨酸代谢相关的互作链条具有较高预测功效。其中，代谢组MetaB-M056模块中吲哚-3-乙酸（IAA）代谢物与宏基因组中色氨酸分解代谢途径（P00380）关联，基于IAA与Cyclin D1相互作用的证据，该MetaB模块又与富集至白细胞介素-22（IL-22）信号通路的宿主转录组模块HostT-M318相关联（图3）。同时，MetaB-M056与富集至上皮细胞凋亡、IL-1信号和氧化应激的HostT模块具有显著的负相关（图3）。痰TNF-alpha、IL-1beta、IL-6以及血清粒细胞集落刺激因子与以上HostT模块相关性最为显著（图3）。这些结果共同支撑了一个假说，即慢阻肺气道菌群中色氨酸代谢途径的改变可能导致IAA降低，进而导致对中性粒细胞炎症和上皮细胞凋亡的保护作用丧失。

通过对384个MGS进行物种留一法分析，我们确定了每种宏基因组模块及其中KO的关键驱动物种，发现对P00380与代谢模块M056关联驱动最大的物种为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），其次是缓症链球菌（Streptococcus mitis）和微黄奈瑟菌（Neisseria subflava）。我们发现唾液乳杆菌可贡献IAA合成基因K01426的丰度变化。通过基因水平的物种注释结果分析，进一步发现口腔乳杆菌（Lactobacillus oris）可贡献K01426的丰度变化。

嗜中性粒细胞慢阻肺中，其他高预测性“菌群-代谢物-宿主”关联包括酪氨酸降解（M00044）和富马酸生成（在MetaB-M100中）、天冬氨酸代谢（P00250）和谷氨酸生成（在MetaB-M006中）。两组关联均与中性粒细胞趋化性以及sRAGE和IL-17A表达有关，但方向相反（图3）。对于嗜酸性慢阻肺，最具预测性的关联是甘油磷脂代谢（P00564）和胆碱生成（在MetaB-M123中），其与嗜酸性趋化性以及IL-5和eotaxin-2表达有关（图3）。

图3. 慢阻肺不同炎症内型相关“菌群-代谢物-宿主”互作关联图谱

气道微生物来源IAA改善肺功能下降、炎症反应和组织细胞凋亡

IAA ameliorates lung function decline, inflammation and apoptosis

为明确气道IAA的来源，鼻内注射抗生素显著降低了小鼠肺部菌载量及肺泡灌洗液（BALF）中的IAA水平；同时，抗生素灌胃未显著降低小鼠肺部菌载量且未改变BALF IAA水平，表明IAA来源于气道菌群（图4a）。通过连续4周，每周注射脂多糖（LPS）和弹性蛋白酶（ELT）建立小鼠肺气肿模型。在肺气肿模型小鼠中，腹腔内注射IAA可减轻肺功能下降、肺气肿、组织损伤、胶原增殖收缩以及TNF-alpha、IL-1beta、IL-6和IL-17A的水平（图4b、c）。IAA提高了小鼠肺中IL-22和Cyclin D1的水平（图4），验证了人群发现。同时，我们在经典慢阻肺熏烟模型小鼠中进一步验证了以上结果。

IAA减轻肺组织凋亡，改变了凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表达（图4e-g）。在用芳香烃受体（AhR）抑制剂处理的小鼠中，IAA诱导的肺功能恢复和IL-22合成的作用被消除（图4h），这表明IAA的作用依赖于AhR。IL-22的中和作用逆转了IAA对细胞凋亡的影响，但对炎症介质的表达没有显著影响（图4i）。在慢阻肺模型中，IAA导致肺泡和肺间质巨噬细胞产生的IL-22比其他细胞来源（ILC-3、CD4 T细胞、NKT细胞）增幅更大（图4j）。

细胞水平上，使用香烟烟雾提取物（CSE）体外处理小鼠巨噬细胞RAW264.7可降低IL-22的产生，而IAA恢复了CSE刺激的巨噬细胞的IL-22水平。上述结果在小鼠原发性肺泡巨噬细胞中也得到了验证。IL-22处理CSE刺激的小鼠肺上皮细胞系MLE12，可以减轻细胞凋亡，促进上皮重塑。Bax/Bcl-2比值的改变和cleaved caspase-3表达也重现了小鼠实验的结果。在RAW264.7-MLE12共培养系统中，IAA处理RAW264.7可显著减少MLE12细胞的凋亡，这种作用可通过中和IL-22逆转，表明IL-22可能介导肺“巨噬-上皮”互作来缓解上皮凋亡。

我们进一步探讨了唾液乳杆菌（L. salivarius）和口腔乳杆菌（L. oris）这两种乳杆菌作为气道IAA潜在产生菌的作用。单独接种口腔乳酸杆菌和唾液乳杆菌以及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）后，小鼠BALF中的IAA显著增加（图4k）。接种两种乳酸菌可同时减缓肺功能下降、组织损伤和细胞凋亡，并降低了气道IL-1beta、IL-6和IL-17A的水平（图4k）。

图4. IAA可改善肺功能下降、中性粒细胞炎症和细胞凋亡

（a）鼻内使用抗生素时，气道IAA水平降低；（b）肺气肿小鼠模型中，鼻内注射IAA缓解肺功能下降；（c）肺组织病理学评分显示肺气肿小鼠模型中，IAA减少了组织损伤；（d）在肺气肿小鼠模型中，IAA增加了气道IL-22水平；（e）在肺气肿小鼠模型中，IAA降低了肺组织凋亡率；（f）四组处理代表性HE染色的肺切片图像和TUNEL荧光图像；（g）免疫印迹结果展示IAA改变肺气肿小鼠模型claudin-1、occludin、Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3的表达；（h）AhR被抑制后IAA作用下IL-22水平降低；（i）IL-22被中和后IAA对肺功能的影响被消除；（j）在肺气肿小鼠模型中，IAA可增加IL-22+肺泡巨噬细胞（F4/80+CD11c+CD11b-IL-22+）的数量；（k）在肺气肿小鼠模型中，鼻内接种唾液乳杆菌（LS）、口腔乳杆菌（LO）及其混合培养（LS+LO）后，IAA水平升高，Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的表达发生改变。同时，鼻内接种铜绿假单胞菌后IAA水平亦升高。

- 讨论 -

本研究通过微生物组与宿主多组学分析，绘制了气道“微生物-代谢-宿主”相互作用的全景图谱。与嗜酸性慢阻肺相比，嗜中性慢阻肺有更显著的气道“微生物-宿主”关联。我们通过沿“微生物组-代谢物-宿主”轴的序贯中介效应分析评估多组学关联，并利用微生物遗传信息和代谢物-靶标配对信息，确定“微生物-宿主”互作的机制假说。数据揭示的一个潜在关键假说是气道微生物组产生IAA可能缓解慢阻肺嗜中性粒细胞炎症和上皮细胞凋亡。通过体内外实验，我们发现IAA可通过肺巨噬细胞中产生IL-22来减轻组织凋亡，从而缓解肺气肿和肺功能下降，但我们不能排除其他IL-22主要来源细胞（如CD4 T、ILC3、NKT细胞）对该通路的贡献。我们确定了两株乳杆菌作为潜在的气道IAA产生菌，具有气道炎症与组织凋亡的保护功效，但同时我们发现气道病原菌如铜绿假单胞菌也可产生IAA，进一步提示复杂的气道菌群宿主互作效应。本研究的局限性包括相对较少的研究人群、痰液对下呼吸道的不完全表征、小鼠模型不能完全模拟慢阻肺人群表型、以及缺乏对嗜酸性慢阻肺的机制证据等。尽管如此，本研究结果表明气道微生物组可通过代谢活动调控慢阻肺关键病理生理特征，为靶向微生物-宿主互作的慢阻肺潜在新型治疗策略提供了机制基础。

参考文献

Zhengzheng Yan, Boxuan Chen, Yuqiong Yang, Xinzhu Yi, Mingyuan Wei,Gertrude Ecklu-Mensah et al., Nature Microbiology. Multi-omics analyses of airway host–microbeinteractions in chronic obstructive pulmonarydisease identify potential therapeuticinterventions.