【Cell】有关生物大分子凝聚体以及液液相分离的知识汇总（三）

用最少的成分重建液-液相分离（LLPS）

在仔细分析蛋白质序列和明确证明一个细胞结构通过LLPS形成之间的步骤是具有挑战性的。研究生物凝聚过程中的一个步骤是在体外重建关键成分的简化装配，并测试这个装配是否通过LLPS形成。如果可以确定驱动装配的力量（例如，通过特定界面的蛋白质相互作用），那么消除这个驱动力（例如，通过突变这个界面）将在体外抑制LLPS。然后使用这些相同的突变体可以在细胞中测试装配体是否通过相同的相互作用，从而通过LLPS形成。这种体外策略具有固有的优势，即它使用纯化的成分进行，可以明确测试哪些成分对过程至关重要。关于通过体外和细胞内的LLPS形成凝聚体的详细方法集合可以在Mitrea等人的2018年的工作中找到。

如何证明一个装配体是通过体外LLPS形成的呢？一个简单的线索是存在含有浓缩成分的球形滴珠（参见表1，列出了一组最小的标准）。这种行为表明，组成部分能够凝聚成可以融合并放松成球形的滴珠。更确切的方法是定义一个饱和浓度Csat，其中当C < Csat时，蛋白质在溶液中是扩散的，而对于C > Csat，密集的滴珠出现，其体积分数fD在总浓度进一步增加时增加，而光相中的浓度CL保持恒定（见图1A）。这种行为不适用于其他类型的自我结合过程，例如二聚化、聚集成定义的物种或高阶自我结合而无相分离。一个恒定的csat和随着总浓度的增加而增加的密集相体积分数fD是强有力的支持LLPS，可以通过显微镜或散射或离心来测试。向认为能够特异性或非特异性地结合RNA的蛋白质中添加RNA，可以显著改变并通常降低蛋白质的Csat。直接观察融合过程对于证明密集相的液态行为是有帮助的，但不是严格的标准，因为一些凝聚滴珠经历液态到固态的转变，因此不融合。一个恒定的Csat和CD（密集相的浓度；见图1A）可以帮助识别LLPS作为迅速固化的凝聚体形成过程中的一个瞬态状态。

微观检测液-液相分离（LLPS）

最常用的检测LLPS的初步方法是光学显微镜。首先，在没有观察到装配体的条件下观察大分子。然后，通过改变条件以利于装配（例如，添加或稀释盐，改变pH值或温度，或添加RNA），接着固定时间孵育样品（从几分钟到几小时），溶液可以通过显微镜成像来检测液滴的存在。比较不同的样本时，孵育时间和成像参数（例如，在盖玻片上检测或者在玻片上方立即检测）应保持恒定。这是因为液滴会沉积在显微镜滑片的表面。这可能导致对密集相体积分数的过高或过低估计。与玻璃表面的相互作用也可能导致表面的润湿或去润湿，以及滴珠材料性质的变化。因此，我们建议比较在玻璃滑片上与各种涂层的行为，例如聚乙二醇（PEG）或脂质。不同的显微模式适合成像，包括差分干涉对比（DIC）或荧光显微镜。使用荧光标记的组分可以估计密集相的浓度，如果在相同的成像条件下为荧光物在不同浓度下建立标准曲线。然而，某些RNA和RNA结合蛋白质可以被光交联，因此在带有这些组分的样本中应注意获取条件，以确保没有实验性诱导的凝胶化效应。

通过浑浊度测量检测液-液相分离（LLPS）

在溶液中，直径在数十到数百纳米（nm）量级的中尺度集合体会散射可见光，可以通过光密度测量（通常在340 nm或400 nm的波长下）或直接的静态光散射进行检测。散射光的绝对值报告了散射粒子的数量和大小的卷积，因此不适合直接比较不同蛋白质结构或突变体的相分离驱动力。相反，这种方法允许确定稀释系列的散射开始，从而确定形成液滴的浓度，即饱和浓度csat。或者，可以监测在给定浓度下散射开始作为温度的函数。这里需要注意的一点是，简单的浑浊度测量检测到各种集合体，并不区分它们的形状、大小或者形成的机制。因此，浑浊度测量应与显微镜一起使用。

通过离心测定轻相浓度（CL）

离心处理两相体系以及与此相关的轻密相的分离，已被证明可以精确测量两个共存相，即轻相或密相浓度cL和cD作为温度的函数。对于这种方法，通过改变溶液条件诱导原溶液的液-液相分离（LLPS），孵育一段规定的时间后通过离心沉淀出密相。取出轻相的一部分，光谱学测定其浓度（例如，通过测量280 nm处的吸光度，在这种情况下应稀释溶液以防止液滴再形成，或使用比色分析法，或者在使用荧光标记蛋白时测定荧光强度）。值得注意的是，如果使用不同的蛋白质原液浓度，这种测定法非常适合测试轻相浓度cL是否保持恒定，这是液-液相分离（LLPS）的决定性属性之一。值得注意的是，可能与LLPS竞争的过程，如聚集或纤维化，可能使得准确确定轻相浓度cL具有挑战性。因此，应始终使用能够区分液滴和聚集体或纤维的显微分析方法伴随其他方法。

（未完待续）

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.035