单细胞转录组揭示FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞在结直肠癌中的相互作用
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题目：Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer 日期：2022-04-01 期刊：Nature Communications 链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29366-6
摘要
结直肠癌 (CRC) 是第三大最常见的恶性肿瘤（仅次于肺癌和乳腺癌），每年在全世界造成约 800,000 人死亡。最新的免疫检查点阻断 (ICB) 策略可以应用于 CRC 治疗，不过PD-1 靶向抗体 pembrolizumab 仅对具有高微卫星不稳定性 (MSI-H) 的错配修复缺陷肿瘤有效，而它仅占转移性 CRC 病例的 < 5 % 。因此有必要了解CRC肿瘤微环境中的细胞联系，并寻找潜在的干预靶点来提高免疫治疗的效果。
间充质基质细胞是非上皮、非造血的细胞，对组织重塑、炎症反应、上皮细胞生长和免疫抑制至关重要。基质细胞的异质性被认为与 CRC 进展的结果相关，最新研究表明，肿瘤肌成纤维细胞可能是驱动肿瘤形成的基质细胞。
其他研究也报道了表达M2巨噬细胞标志物(如CD163、DC-SIGN)的巨噬细胞或表达FSP1、FAP的癌症相关成纤维细胞与CRC患者预后不良呈正相关。一种具有称为SPP1 +巨噬细胞的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 具有免疫抑制特性，并会促进EMT 过程，可作为抗肿瘤生长和转移研究的潜在靶标。然而，目前尚未研究CRC TME 中骨髓细胞与其他类型细胞之间的相互作用。
本文发现FAP +成纤维细胞和SPP1 +的浸润巨噬细胞高度相关，它们的存在与淋巴细胞浸润呈负相关，并预示着较差的患者存活率。此外， FAP或SPP1的高表达可以对 PD-L1 阻断免疫疗法产生耐药性。总之，本文揭示了基质和巨噬细胞亚群之间复杂的相互作用，并且可以作为 CRC 免疫治疗的潜在靶点。
人类正常粘膜和 CRC 组织的单细胞转录组图谱
作者为了阐述CRC的细胞组成，从五名非转移性患者手术获得肿瘤样本和邻近的正常组织【结肠腺癌 (COAD)，n = 2；直肠腺癌 (READ)，n = 3】，质控后得到了 54,103 个细胞用于分析，其中 29,481 个细胞来自邻近肿瘤的非恶性组织，24,622 个细胞来自肿瘤组织。
注释得到9种细胞类型：
- epithelial cells (n = 8940) identified by the expression of EPCAM and CDH110
- T/ILCs cells (n = 17,420) which expressed the T-cell receptor (TCR) signaling mediators CD3E and CD3G15
- B cells (n = 2998) marked by MS4A1 and CD79A11
- plasma cells (n = 7252) identified by SDC1 and MZB1 expression
- myeloid cells (n = 4617) which were positive for CD14 and FCGR3A expression
- mast cells (n = 2781) defined by their classical markers KIT, IL1RL1, and MS4A2
- endothelial cells (ECs; n = 2205) marked by PECAM1 and CDH511
- mesenchymal stromal cells (MSCs; n = 7451) marked by COL1A1 and COL3A111
- glial cells (n = 439) marked by S100B and CDH2
尽管所有九种主要细胞类型均存在于五名患者的肿瘤和邻近正常组织中，但每种主要细胞类型的浸润程度不同，可能反映了 CRC 进展阶段的差异。
CRC肿瘤组织中各个细胞群的联系
作者使用了MsigDB的Hallmark基因集分析了MSCs、ECs、神经胶质细胞、骨髓细胞、T 细胞和B细胞涉及的通路改变。
免疫相关通路，包括炎症反应、IL2/STAT5 信号和 IL6/JAK/STAT3 信号，不仅在免疫细胞群（例如骨髓细胞和 T/ILC 细胞）中富集，而且在肿瘤的 MSC 和 EC 中也会富集，表明 MSCs 和 ECs 参与了结直肠癌的免疫反应。与正常组织相比，肿瘤的 MSCs、ECs 和髓样细胞还富集了缺氧的marker基因。这可能意味着肿瘤缺氧区域的基质细胞相互作用，巨噬细胞、间充质干细胞和内皮细胞的相互作用可以重塑 CRC 微环境。
此外，与来自正常粘膜的细胞相比，肿瘤浸润性骨髓细胞和 T/ILC 富集了更多的代谢（包括脂肪酸代谢、胆汁酸代谢和胆固醇稳态）相关基因，表明免疫代谢相关的基因在 CRC TME 中被重编程。
此外，作者分析了14个公共数据中的九种细胞浸润相关性，发现MSCs 和骨髓细胞之间存在显著正相关。
在TCGA CRC队列中，较高 MSC 浸润和骨髓细胞浸润的 CRC 患者与较差预后（总生存期和无进展生存期）相关。
肿瘤特异性FAP +成纤维细胞与结直肠癌进展相关
肿瘤邻近组织和肿瘤组织之间浸润细胞类型的差异表明，TME 的动态重塑在 CRC 进展中起着重要作用。长期以来，MSC 和成纤维细胞样细胞一直被认为是参与肿瘤发生和癌症进展的关键基质细胞类型。不过具体是哪种细胞类型还未知。
作者将MSC又细分为10种亚群：
- Telocytes were positive for SOX6, FOXL1, and F3 expression9, which were further sub-clustered based on ICAM1 expression into ICAM1+ telocytes (n = 1016) and ICAM1− telocytes (n = 550)
- Myofibroblasts were clustered based on the high expression of contractile genes, ACTG2 and MYH119, and further classified into DES+ myofibroblasts and MFAP5+ myofibroblasts
- CD24+ fibroblasts (n = 228) were characterized by the expression of CD24 and Wnt agonist gene, RSPO3
- The other fibroblast subtypes included NT5E+ (encoding CD73, essential for adenosine production and immune suppression) fibroblasts (n = 930), FGFR2+ fibroblasts (n = 2023), and FAP+ (canonical CAF activation marker) fibroblasts (n = 1091)
- the proliferating fibroblasts were marked by the expression of MKI67
FAP +成纤维细胞在肿瘤组织中显著富集，它的marker基因FAP、MMP1和MMP3通常与成纤维细胞活化和细胞外基质重塑相关。有趣的是，具有更多FAP +成纤维细胞浸润的 CRC 患者在 TCGA 和数据集 GSE17536 队列中表现出更短的 无进展生存期。
为了验证这种肿瘤特异性成纤维细胞浸润，作者通过流式细胞术分析了结直肠肿瘤和非恶性样本中基质细胞亚型标志物 CD24、CD26、NT5E、FAP 和 FGFR2 的表达，结果显示FAP +成纤维细胞的浸润显著增加，而NT5E +和FGFR2 +成纤维细胞在 CRC 样本中显著减少。
RNA速率分析显示肿瘤特异性FAP +成纤维细胞可能起源于FGFR2 +成纤维细胞或ICAM1 + telocytes。FAP +成纤维细胞的分化由复杂的转录因子网络协调，因此使用pySCENIC进行分析，发现TWIST1在FAP +成纤维细胞的调节网络中具有最高的表达水平和活性，可能是驱动该分化途径的主要转录因子。
另外，缺氧是肿瘤微环境最重要的特征之一。与其他 MSC 亚型相比，缺氧依赖性 HIF-1α 信号通路在FAP +成纤维细胞中显著富集。
肿瘤特异性SPP1 +巨噬细胞与 CRC 进展相关
CRC 患者骨髓细胞又细分出了3种树突细胞：
- Activated DCs (n = 73) were marked by high expression of CCR7, required for innate lymphoid cell trafficking to draining lymph nodes, and FSCN1, essential for DC maturation
- XCR1 and CLEC9A were highly expressed in cDC1 (n = 91)
- FCER1A and CD1C were upregulated in cDC2 (n = 487)
SPP1 +巨噬细胞是肿瘤特异性巨噬细胞，占肿瘤样本中髓细胞的 11.6%，但仅占邻近正常组织中髓样细胞的 0.68%。CIBERSORTx 计算免疫浸润时，发现与 TCGA 队列中邻近的正常组织相比， SPP1 +巨噬细胞在肿瘤样本中的占比显著上调。TCGA 和 GSE17536 CRC 队列中具有较高SPP1 +巨噬细胞浸润的 CRC 患者表现出较短的无进展生存期。
基于流式细胞仪分析骨髓细胞亚群标志物CD14、CD206、CD209 和 CD13，可以进一步证明与非恶性结肠组织相比， SPP1 +巨噬细胞在 CRC 中显着增加，而THBS1 +巨噬细胞无显着变化。
另外，RNA速率分析肿瘤特异性SPP1 +巨噬细胞可能起源于THBS1 +巨噬细胞。pySCENIC 分析表明，STAT1在SPP1 +巨噬细胞中高度活跃，在小鼠中STAT1可以使得巨噬细胞偏向发育成M1表型。
有趣的是，SPP1 +巨噬细胞也可能受到 HIF-1 信号通路的调节，这是典型的缺氧诱导途径。因为FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞都参与了缺氧诱导途径，于是作者假设：存在一个位于肿瘤缺氧区域的基质细胞介导网络，该网络连接巨噬细胞和 MSC，它们协同作用加剧了 CRC 微环境变化。
FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的高浸润与较差的患者生存相关
FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞主要富集在肿瘤组织中，之前又发现 MSCs 和骨髓细胞浸润之间存在高度的相关性。为了研究所有细胞类型的浸润状态，作者使用 CIBERSORTx 评估了14 个独立的 CRC 队列中识别的 58 个细胞类型的浸润情况，发现FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞是所有队列中相关性最高的群体。
为了进一步揭示这两种细胞类型之间密切相关的临床意义，作者比较了不同水平的FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的患者的 无进展生存期 。发现高FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的患者表现出最短的 无进展生存期 ，表明这两种细胞类型可以协同促进肿瘤进展。
之后GSEA 分析发现FAP +成纤维细胞 & SPP1 +巨噬细胞 的样本中的上调基因主要富集在上皮-间质转化途径。另外还富集在了缺氧的通路，这与之前假设一致。此外，TNFα信号通路和IL2/STAT5信号通路也有富集。这些发现表明FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞对 CRC TME 内的不同刺激和信号可以作出反应。
之后评估了 78 名 CRC 患者组织微阵列 (TMA) 中的蛋白质表达水平，发现与 FAP 或 SPP1 水平较低的患者相比，FAP 和 SPP1 蛋白水平较高的患者存活率较差。
空间转录组学揭示FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞的细胞间相互作用
作者对来自四名 CRC 患者的肿瘤组织切片进行了空间转录组学 (ST)分析，聚类分群得到10 clusters：FAP+ fibroblasts/SPP1+ macrophages, malignant epithelial cells, epithelial cells, MSCs, MT+ cells with fibrosis, FAP+ fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, immune cells, and unknown of patient #6
发现了FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞在同一区域富集，并且位于恶性上皮细胞周围。并且观察到大多数FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞都位于同一点，10x Genomics Visium 平台中的一个点最多可容纳 10 个细胞，这表明两种细胞类型之间存在物理关联。
细胞通讯发现，FAP +成纤维细胞可以通过配体-受体对COL1A1 / LAMA1 - ITGB1直接与SPP1 +巨噬细胞接触。此外，FAP +成纤维细胞通过 TGF-β 家族基因TGFB1和INHBA的表达增强SPP1 +巨噬细胞的促炎活性，以及通过 TGF-β 诱导SPP1 +巨噬细胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的表达。此外，FAP +成纤维细胞通过WNT5A - FZD2和CCL3 - CCR5对增强了SPP1 +巨噬细胞的募集。
SPP1 +巨噬细胞的TGFB1、IL1B和IL1A配体活性较高，还高表达TGFB1、IL1B和IL1A基因。此外，TGFB1编码蛋白与FAP +成纤维细胞上TGFBR3、ACVRL1和TGFBR1编码的受体结合，而IL1B或IL1A编码的配体与IL1R1或IL1RAP编码的受体存在相互作用，导致编码胶原蛋白或基质金属肽酶的靶基因在这些细胞中表达，而这些靶基因是促纤维增生反应的重要一环。
总之，FAP +成纤维细胞和SPP1 +巨噬细胞形成了一个相互作用网络，支持彼此的功能。这两种细胞类型可能在 ECM 的重塑中发挥重要作用，可能促进 TME 的纤维增生区域的形成。
小结
作者提出了一个模型：FAP +成纤维细胞受TWIST1调节，其表达由缺氧诱导；它们还分泌趋化素，它可以进入血管并与 THBS1+ 巨噬细胞结合，后者可能分化为SPP1 +巨噬细胞。此外，SPP1 +巨噬细胞可能通过TGFB1调节FAP +成纤维细胞，从而促进 MMP 和胶原蛋白的分泌，它们共同促进 ECM 的重塑。
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