【NS基金GPT】课题3：基于R-loop结构的m6A修饰介导基因组稳定性及转录调控在前列腺癌进展中的作用及分子机制

有关NS基金GPT系列的想法

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注意一下内容均由ChatGPT生成

摘要

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，尽管治疗手段多样，但晚期或复发的治疗效果有限，因此亟需深入研究其分子机制。RNA修饰，特别是m6A修饰，以及R-loop结构近年来被认为是影响多种癌症发生和发展的关键因素。前期实验通过RNA-seq和ChIP-seq技术发现，m6A修饰和R-loop结构在前列腺癌细胞中的表达水平明显改变，并存在明显的相互作用和相关性。m6A修饰酶METTL3的敲除导致R-loop结构的显著增加。基于以上发现，我们提出假设：m6A修饰和R-loop结构可能通过影响基因表达和基因组稳定性，共同参与前列腺癌的发生和发展。本项目计划使用前列腺癌细胞模型、小鼠模型和临床样本，探索m6A修饰和R-loop结构在前列腺癌中的作用机制和相互作用。研究基因表达调控、基因组稳定性、以及新的治疗靶点和药物筛选，为前列腺癌的分子机制研究提供新的视角和理论基础，有望发现新的治疗靶点和策略。

立项依据

前列腺癌是全球男性最常见的恶性肿瘤之一，尤其在西方国家。根据世界卫生组织（WHO）的数据，前列腺癌的发病率和死亡率逐年上升，成为男性癌症死亡的主要原因之一。尽管手术、放疗和荷尔蒙治疗等多种治疗手段已经取得一定的进展，但对于晚期或复发的前列腺癌，治疗效果仍然有限。

近年来，RNA修饰作为表观遗传调控的一个新领域，受到了广泛的关注。其中，N6-甲基腺苷（m6A）是最常见的RNA修饰之一，已被证明在多种生物过程和疾病中起到关键作用。m6A修饰涉及多种酶和蛋白，如“写”酶METTL3、METTL14，以及“擦”酶FTO和ALKBH5。RNA修饰是一种表观遗传现象，它通过化学修饰RNA分子来影响RNA的稳定性、结构和功能。在所有已知的RNA修饰中，N6-甲基腺苷（m6A）是最为普遍和功能性最强的一种。m6A修饰在哺乳动物、植物和酵母等多种生物中都有发现，表明其具有广泛的生物学意义。m6A修饰是由一组名为“写”酶的酶复合体催化的，主要包括METTL3（甲基转移酶3）、METTL14和WTAP（威尔姆斯瘤相关蛋白）。METTL3是催化反应的主要酶，而METTL14和WTAP则起到辅助作用。除了“写”酶，还有一组“擦”酶负责去除m6A修饰，主要包括FTO（肥胖相关蛋白）和ALKBH5。m6A修饰在癌症发生和发展中起到了复杂的调控作用。一方面，m6A可以通过影响RNA的稳定性和翻译效率，促进癌症相关基因的表达；另一方面，m6A也可以作为肿瘤抑制因子，通过影响RNA剪接和转运，抑制癌症的发生和发展。除了在癌症中的作用，m6A还在神经发育、免疫调控和病毒复制等多个生物过程中显示出其重要性。这进一步证明了m6A修饰在生物学中的普遍性和多样性。

R-loop是一种由RNA和DNA混合三链复合体形成的特殊结构。在这种结构中，RNA与模板链DNA形成稳定的Watson-Crick碱基配对，而非模板链DNA则以单链形式存在。R-loop结构在生物体内是普遍存在的，并在多种生物过程中起到关键作用。R-loop结构主要在转录过程中形成，特别是在高度超螺旋化的DNA区域和具有丰富G/C含量的基因组区域。多种蛋白负责R-loop的形成和解除，其中最为重要的是SRSF1（Serine/Arginine-Rich Splicing Factor 1）和RNase H（核糖核酸酶H）。SRSF1主要促进R-loop的形成，而RNase H则负责解除R-loop，以维持基因组稳定性。R-loop结构在癌症中的作用尚不完全明确，但越来越多的证据表明它可能与癌症的发生和发展有关。一些研究发现，R-loop的累积可能导致DNA损伤和基因组不稳定性，从而促进癌症的发生。同时，R-loop也可能通过影响某些癌症相关基因的转录来起到调控作用。除了在癌症中的潜在作用，R-loop还在DNA修复、基因剪接、染色体重组等多个生物过程中显示出其重要性。这些过程中R-loop的作用通常与其他RNA修饰和DNA修饰密切相关，表明R-loop是一个多功能和高度调控的结构。

在我们的前期实验中，通过RNA-seq和ChIP-seq技术，我们发现m6A修饰和R-loop结构在前列腺癌细胞中的表达水平明显改变。进一步的实验表明，这两者之间存在明显的相互作用和相关性。例如，通过敲除METTL3，我们观察到R-loop结构的显著增加，这暗示两者可能在前列腺癌的发生和发展中有共同的作用。

我们计划通过以下几个方面来验证这一假设：使用前列腺癌细胞模型，通过敲除或过表达m6A修饰酶和R-loop相关蛋白，观察其对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。利用小鼠前列腺癌模型，进一步验证细胞模型的结果。收集前列腺癌患者的临床样本，分析m6A修饰和R-loop结构的表达水平与临床参数的关系。本项目不仅将深化我们对前列腺癌分子机制的理解，还可能为前列腺癌的早期诊断和治疗提供新的靶点和策略。

研究内容

实验目的

探究m6A修饰和R-loop结构在前列腺癌细胞模型中的作用及其相互作用。

在小鼠前列腺癌模型中验证细胞模型的结果。

分析前列腺癌患者临床样本中m6A修饰和R-loop结构的表达水平与临床参数的关系。

细胞模型

使用CRISPR/Cas9技术敲除或过表达m6A修饰酶（如METTL3、METTL14）和R-loop相关蛋白（如SRSF1、RNase H）。

通过qRT-PCR和Western blot分析基因和蛋白表达。

通过CCK-8、Transwell和划痕实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力。

小鼠模型

使用特异性敲除或过表达的小鼠模型。通过组织学和免疫组化分析肿瘤生长和转移。通过RNA-seq和ChIP-seq分析基因表达和修饰状态。

临床样本

收集前列腺癌患者的组织样本。通过高通量测序和免疫组化分析m6A修饰和R-loop结构的表达。与临床参数（如Gleason评分、TNM分期）进行相关性分析。