Nat. Biomed. Eng. | 定量快、全自动、不染色：全息影像+深度学习让病毒无所遁形

编译 | 于洲

今天我们介绍由美国加州大学洛杉矶分校电气与计算机工程系的Tairan Liu等学者发表在Nature上的工作。

空斑测定法是测量具有复制能力的溶解病毒粒子浓度的金标准方法，但它需要染色，且通常需要超过48小时的运行时间。本工作展示了无透镜全息成像和深度学习可以结合起来加速和自动化分析。紧凑的成像装置以每孔约0.32亿像素/小时的速率捕获无标记的相位信息，覆盖面积约30 × 30mm2，病毒浓度动态范围比标准测定法大10倍，并能够定量感染区域和斑块形成单位的数量。对于水疱性口炎病毒，自动斑块测定早在培养后5小时就检测到病毒复制引起的第一次细胞裂解事件，并且在不到20小时的时间内，以100%的特异性检测到斑块形成单位的率高于90%。此外，它使1型单纯疱疹病毒的潜伏期缩短约48小时，使脑心肌炎病毒的潜伏期缩短约20小时。该无染色法适用于病毒学研究、疫苗开发和临床诊断。

背景介绍

病毒感染可通过流感、人类免疫缺陷病毒和人类乳头瘤病毒等传染病影响全世界数百万人。美国疾病控制与预防中心估计，自2010年以来，仅在美国，流感病毒就导致了1600-5300万人患病，20-100万人住院，16700-66000人死亡。新冠肺炎疫情已在全球造成5亿多人感染，600多万人死亡，给许多国家的公共卫生和社会经济发展带来巨大负担。为了帮助应对这种全球性的健康挑战，需要开发准确和低成本的病毒定量技术，用于临床诊断、疫苗开发和重组蛋白或抗病毒药物的生产。

空斑测定法发展于1952年，是测定病毒浓度的第一种方法。该检测方法由Renato Dulbecco开发，其允许在含有复制能力裂解病毒粒子的给定样品中手动确定斑块形成单位（Plaque-Forming Units，PFUs）的数量。这些样品被连续稀释，每次稀释后等份放入培养皿中培养细胞。当病毒感染邻近细胞并扩散时，会逐渐形成斑块，专家可以通过肉眼检查。尽管存在其他方法，如免疫荧光局灶形成测定法、聚合酶链反应法和基于酶联免疫测定法，但由于其以经济有效的方式提供病毒样本传染性的独特能力，斑块测定法仍然是定量病毒浓度的金标准方法。

然而，空斑测定通常需要2-14天的潜伏期（取决于病毒的类型和培养条件），以使空斑扩大到可见的大小，并且，在人工空斑计数过程中容易出现人为错误。为了改进传统的斑块测定方法，已经开发了许多方法，但这些系统仍需要荧光标记或带有金微电极的特殊培养板，而且尚未解决人为计数错误这一问题。因此，仍需要一种准确、定量、自动化、快速和经济高效的空斑分析以更好地用于病毒学研究和相关临床应用。

定量相位成像（Quantitative Phase Imaging，QPI）、全息影像以及深度学习的一些最新进展为解决这一需求提供了机会。QPI是一种卓越的成像技术，能够以非侵入性和无标签的方式对透明生物标本进行可视化以及量化。此外，QPI系统的图像质量可以通过使用神经网络在相位检索、降噪、自动聚焦和空间分辨率上进行提高。目前，许多基于深度学习使用QPI的微生物检测和鉴定方法已被证明是可行的。

方法介绍

本文提出了一种具有成本效益和紧凑的无标签活斑块分析，可以自动提供比传统病毒斑块分析更快的定量PFU读数，且无需染色。本文搭建了一个紧凑的无透镜全息成像原型（图1）以成像目标PFUs在培养期间的时空特征，在不包括一台标准的笔记本电脑情况下整个成像系统部件的总成本不到880美元。

图1：利用深度学习和无透镜全息技术进行无染色、快速、定量的病毒斑块检测。a：无染色PFU成像系统的照片，该系统以每个测试孔每次扫描约0.32亿像素的吞吐量捕获斑块分析的相位图像；b：系统组件的详细说明；c：六孔板样品，盖上通气孔，侧面封上副膜。

这种无透镜全息成像系统每小时快速扫描六孔板的整个区域（每次扫描测试孔的吞吐量约为0.32亿像素），并根据孔内观察到的时空变化，将样品的重建相位图像用于PFU检测。然后，本文训练了一个基于神经网络的分类器，并使用它将重建的相位图像转换为PFU概率图，随后使用该概率图来显示孔内PFUs的位置和大小。为了证明该系统的有效性，本文在Vero E6细胞板上对水疱性口炎病毒（VSV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和脑心肌炎病毒（EMCV）进行了早期检测。该无染色装置可以在培养后5小时自动检测VSV复制引起的第一次细胞裂解事件，并在20小时内达到90%的PFU检出率，而传统的斑块测定法需要≥48小时，与传统的斑块测定法相比节省了大量时间。此外，该方法对于HSV-1和EMCV的平均培养时间分别节省了~48小时和~20小时，PFU的检出率为90%，特异性为100%。培养的病毒浓度与细胞单层上的病毒感染面积之间也建立了定量关系。无需任何额外的样品制备步骤，这种支持深度学习的无标签PFU成像和定量设备可用于病毒学中的各种空斑测定，并可能有助于加快疫苗和药物开发的研究。

实验结果

为了证明该装置的有效性，本文使用Vero E6细胞和VSV制备了14个斑块试验。如图2a所示，样品制备步骤遵循标准空斑测定。对于每个六孔板，每孔接种~6.5 × 105个细胞，然后在培养箱（Heracell VIOS 160i CO2培养箱，Thermo Scientific）中培养24小时，以达到95%覆盖率的细胞单层。在病毒感染期间，用100µL稀释过的VSV悬浮液（以2−1 × 10−6的稀释因数稀释6.6 × 108 PFU ml−1 VSV原液获得）感染5孔，留下1孔作为阴性对照。然后，在每孔中加入2.5 ml含有4%琼脂糖的总培养基覆盖液。在室温下固化后，每个样品首先被放置在成像设备中进行20小时的培养，执行延时成像以捕获样品的时空信息。然后，将相同的样品在培养箱中再放置28小时，让PFUs生长到传统斑块测定的最佳尺寸（这仅用于比较目的）。最后，使用结晶紫溶液对每个样品进行染色，作为与本文的无标签方法进行比较的ground truth。

图2a：空斑分析样品制备工作流程

为了训练和测试基于网络的VSV PFU分类器，使用54孔（即45个阳性孔和9个阴性孔）进行训练，使用30孔（即25个阳性孔和5个阴性孔）进行测试。在训练阶段，开发了一种基于机器学习的粗PFU定位算法，以加速训练数据集的生成并描述潜在的假阳性。在该PFU定位算法筛选每个样本后，使用定制开发的图形用户界面进一步手工检查PFU候选样本以进行确认。此手动检查仅在训练阶段使用，以正确有效地准备训练数据。负训练数据集完全由每个孔板的负控制孔填充。本文一共收集了357个真阳性全息视频和1169个阴性全息视频用于训练PFU决策神经网络。该数据集经过进一步增强后创建了2594个阳性全息视频和3028个阴性全息视频，其中每帧为480 × 480像素，两个连续全息帧之间的时间间隔为1小时。

基于神经网络的VSV PFU分类器训练完成后，对全部30个测试孔进行扫描盲测（图2b）。对于每个测试孔，本文有~18,000 × 18,000个有效像素（在丢弃边缘后代表30 × 30 mm2的活动区域）。随后使用PFU分类器（图2c）网络对每个测试孔进行数字处理大约需要7.5分钟，该网络将孔的全息相位图像自动转换为PFU概率图（图2d）。该图上的每个像素都表示以该像素为中心的局部区域（0.8 × 0.8 mm2）具有PFU的统计概率。在使用0.5的概率阈值时，在整个测试孔区获得最终的PFU检测和量化结果（图2e, f）。

图2b-f：活病毒空斑测定的详细图像和数据处理步骤。b：重建和记录连续全孔全息图的图像预处理步骤。基于神经网络的PFU分类器以扫描方式将全息图转换为PFU概率图；c：本地区域的网络处理示例；d：单孔PFU概率图示例；e：采用0.5的阈值后，将d中的PFU概率图转换为PFU检测结果；f：全六孔板PFU检测结果示例。

图3a显示了该设备在培养17小时后检测VSV PFUs的性能示例，显示了检出率超过90%的关键时间。

图3a：培养17小时后的无染色病毒菌斑实验与培养和染色48小时后的传统菌斑实验的全孔比较

图3b显示了三个具有代表性的PFUs。当PFU处于生长早期，其尺寸远小于0.8 × 0.8 mm2的虚拟扫描窗口时，在最终的检测结果中呈现为正方形，这实际上是小尺度PFU与扫描窗口的二维（2D）空间卷积。作为另一个例子，PFU3显示了一个簇状形成事件，其中两个相邻的PFU可以使用本文的方法轻松区分，而不像传统的斑块测定将它们合并为一个。

图3b：来自a的三个具有代表性的PFUs在阳性孔中的生长情况。重构的相位通道被覆盖上使用PFU定位算法生成的掩模，以更好地显示它们的位置。

图3c进一步显示了本设备随着时间变化的平均PFU检出率。在培养20 h时，本方法的检出率达到了90%，尽管没有染色，该方法在任何时间点都没有出现假阳性。

图3c：使用无标记病毒斑块试验的平均PFU检出率。误差条显示了五个测试板的标准偏差。

本文还将该结果与广泛采用的商用PFU自动计数系统进行了比较。48小时培养后，按照标准染色方案，本文使用Agilent BioTek Cytation 5设备（Agilent Technologies）对相同的五个六孔测试板（VSV，图3c）进行成像。在使用该系统进行自动图像采集后，通过Gen 5软件（Agilent Technologies）使用其自动PFU计数算法的优化设置进行PFU检测。检测率为94.3%，错误发现率为1.2%。相比之下，无染色全息法在相同样品培养20 h（即比标准培养时间提前28 h）时的PFU检出率为93.7%，假发现率为0%。除了缺失一些生长较晚的PFU和引入一些假阳性外，这种市上可获得的自动化PFU计数系统还显示对大PFU的过度分割以及对高病毒浓度样品的PFU检测不足。

除了节省培养时间和无染色外，本文提出的框架还具有很强的泛化能力。例如，在用六孔板训练后，它可以直接用于12孔板，而不需要任何修改或重新训练步骤。在没有任何迁移学习步骤的情况下，本文在12孔板上进行盲测，20 h PFU（VSV）的检测率达到89%。此外，该计算PFU检测设备可以在以VSV PFU检测网络为基础模型的情况下，通过迁移学习推广到检测其他类型的病毒（例如HSV-1和EMCV）。对于HSV-1，在不引入假阳性的情况下，该框架在72 h时达到了90.4%的检出率，与传统的HSV-1空斑检测所需的120 h相比，减少了48 h的培养时间。同样，对于EMCV，在培养52 h时的检出率为90.8%，假阳性为0%，与传统EMCV斑块测定72 h的基本真实值相比，可节省20 h的培养时间。

本设备具有成本效益、结构紧凑和自动化，还可以处理更大的病毒浓度范围，具有更可靠的PFU读数。为了证明这一点，本文准备了另一组五个六孔测试板，在每个测试板上，所有六个孔都被VSV感染，但每个孔之间的稀释差为两倍，覆盖了从一个测试孔到另一个测试孔的病毒浓度的大动态范围。如图4所示，即使在病毒浓度较高的情况下，该方法也是有效的。在传统的48小时空斑测定中，由于严重的空间重叠，只有最低的病毒浓度才适合PFU的定量，而对于本文的无标记设备，即使是最高的病毒浓度，它也可以在早期自动准确地计数每个PFU。

图4：无染色病毒空斑试验的性能与病毒浓度的关系。a, b：全板无染色病毒菌斑实验（a）与传统菌斑实验（b）培养15h后的比较；c：在a和b所示的同一板中，PFUs在早期的生长情况。

此外，本文的方法提供了更可靠的读数。例如，在图4a, b中圈出的区域中，细胞的缺失是由斑块测定过程中出现的一些随机细胞活力问题引起的。在本设备中，这些伪产物可以很容易地与病毒复制引起的细胞裂解事件区分开来，因为这两个事件的时空模式截然不同（通过训练的PFU概率网络进行评估）。这使得支持深度学习的设备能够适应样品制备步骤中随机引入的潜在伪影或细胞活力问题。

如图5a所示，本文探索了不同高浓度病毒样品在不同时间点的PFU计数结果。

图5a：不同高浓度病毒样品在不同时间点的PFU计数结果。浅红色区域表示PFU聚集严重且不再适合计数

如图5b所示，通过该装置的定量读数和PFU概率图，本文可以获得潜伏期内所有时间点的病毒感染区域面积。

图5b：不同时间点不同高病毒浓度样本的病毒感染区域面积

为了更好地说明这一点，如图5c所示，本文绘制了所有样品在6小时、8小时和10小时培养时间下的病毒稀释系数与每个测试孔感染细胞面积的比例（单位：%）。尽管存在一些序列稀释误差、后期病毒唤醒和PFU聚类事件，但在所有培养时间内，该装置测量的感染面积百分比随着稀释系数的增加而单调降低。这表明，通过校准系统，病毒浓度（PFU ml- 1）也可以从每孔感染细胞面积的百分比进行估计。

图5c：在培养6小时、8小时和10小时时，所有5个滴度样品的病毒稀释系数与每孔感染细胞面积的比值（单位：%）图

此外，使用病毒感染区域的面积百分比作为无标记量化度量，所提出的框架可以提供早期的PFU读数。为了证明这一点，本文计算了用于生成图3c的盲测板的所有25个阳性或感染孔的感染面积百分比。如图6所示，当感染面积百分比足够大（>1%）时，可以在12 h或15 h时提供更快的PFU浓度读数。由于在培养15 h时，孔中平均PFU的物理尺寸比12 h时更大，因此图6b中红色校准曲线的斜率小于图6a，正如预期的那样。对于病毒浓度更高的样品，在≤10小时的培养时间内，感染细胞面积百分比可达到1%（如图5c所示），从而更早地提供PFU浓度读数。

图6：无染色装置在不同时间点测量的感染面积百分比（%）与每孔病毒浓度（PFU ml-1）。a, b：12 h（a）和15 h（b）时的感染面积百分比。

讨论

本文搭建了一种廉价的自动化系统，通过使用无透镜全息成像和深度学习来早期检测PFUs。该系统以每次扫描0.32亿像素的吞吐量捕获测试孔的延时相位图像，并在7.5分钟内处理这些图像，以确定每个孔的PFU分布。在培养15-17 h时，该系统的特异性为100%，灵敏度为80.1-90.3%。它结合了数字全息和深度学习：全息成像提供时空相位信息，神经网络利用这些信息识别PFU区域。该系统简化了图像重建，几乎不需要改变样品制备，对培养箱中的波动具有弹性，并且不影响菌斑的形成。以后的改进可能包括并行成像、更好的扫描阶段、多波长相位恢复、适应其他成像模式以及重新训练网络。这项技术可以为研究、疫苗开发和临床提供更快、无染色、定量的病毒斑块分析。

参考资料

Liu, T., Li, Y., Koydemir, H.C. et al. Rapid and stain-free quantification of viral plaque via lens-free holography and deep learning. Nat. Biomed. Eng (2023).

https://doi.org/10.1038/s41551-023-01057-7