学习小组Day7笔记

day7-测序知识

测序原理:测定DNA或RNA上核苷酸碱基顺序以及数量

测序的类型

一代测序（桑格测序法）

由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应

带有荧光集团的ddNTP在DNA合成时，随机加到双链上，停止合成。合成长短不同的片段，把这些长短不同的片段拼在一起，就可以看出在停下来的地方是哪一种颜色，进而判断是哪一种碱基。

然后通过凝胶电泳分离和放射自显影后识别确定待测分子的DNA序列。

二代测序(边合成边测序):用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息

1.往测序反应中加入dNTP，建库；

建库，将待测DNA模板打断成200~800bp的片段，然后在末端补平并加A尾，与特有的测序接头（adapter）连接

2..簇的生成——桥式PCR: 检测加入到测序过程的碱基类型；

3.测序去除反应中的各种酶、荧光标记物或dNTP 3’端的阻碍基团等洗脱反应

4.数据产出

特点：通量高、时间短、读长短。

三代测序（单分子）

基本原理：DNA 聚合酶和模板结合，4 色荧光标记4 种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

纳米孔单分子测序技术为标志，不需要经过PCR扩增，超长读长，可达二代测序的100倍以上，实现了对每一条DNA分子的单独测序

特点：无需PCR扩增，读长长，无视GC含量的影响

基因组学（核酸序列分析）

分类

（1）全基因组测序（WGS）

（2）全外显子组测序（WES）

（3）简化基因组测序（RRGS）

①RAD-Seq

②GBS

③2bRAD

④ddGBS（也就是ddRAD）

其它

以全基因组测序为目标的结构基因组学

以基因功能鉴定为目标的功能基因组学

作用：

（1）基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）

（2）核苷酸序列分析

（3）基因定位

（4）基因功能分析