话五 | 不要忽视你不愿看到的单细胞数据

赛尔，你好。

高考结束，暑期临近，每年的这个时候，仿佛进入一种季节性的思考：当年高考那会如何如何，高考至今如何如何，总有那么一刹那，想再写一写今年的高考作文题。

欣然于远方，我们总是快速地收拾行囊，只有在夜深人静时分，才会回望来时路。在单细胞数据分析的过程中也是这样，单细胞项目似乎在催促中进行，合作方催着送样，导师催着结果，大量的分析可以做，每天都有新的分析方法出现，令人目不暇接。

设计方案，送样测序，数据下机，定量分析，数据探索，分群聚类，功能富集，基因调控，下游验证，公共数据，生存分析，数据库。。。

投稿和毕业，哪个先来临？我们一直在与时间赛跑。

据说，在阿尔卑斯山谷中的一条马路上，有一块标语牌：“慢慢走，欣赏啊”，劝来往的路人为这华丽的世界驻足欣赏一番。

今天想和你聊聊单细胞数据分析过程中，被过滤掉的数据，有哪些价值？

• 数据过滤的逻辑不应是以莫须有罪名，而应是师出有名。
• 数据过滤的逻辑不应是眼不见心不烦，而应是知其然也知其所以然。
• 数据过滤的逻辑不应是宁可错杀一千也不放过一个，而应是审慎地对待被删除的数据

就拿我们比较熟悉的barocde-UMI曲线来说吧，它是单细胞定量中一个常见的图，而往往被忽视。此图X轴是排序后的barcode，Y轴是每个barcode对应的UMI数量。为什么这个图重要？在这个细胞判定曲线上，我们看到了细胞和数据背景的区别，往往被判定为细胞的是蓝色，背景是灰色。

细胞和背景二者的区别在哪里？最直观的就是对应barcode的UMI多少，UMI多的是细胞，被放在filtered_gene_bc_matrices中，UMI少的是背景,被放在raw_gene_bc_matrices。我们的单细胞数据分析往往起步于蓝色的部分，不知道大家有没有思考过这个问题：单细胞曲线的右下角的灰色线条，就真的毫无意义吗？还是未被发掘的新大陆？

在绝大部分场合下，我们用不到raw_gene_bc_matrices，而在我们用SoupX做单细胞数据的背景去除的时候会用到。

library(SoupX)
toc = Seurat::Read10X(file.path(tmpDir,'filtered_gene_bc_matrices','GRCh38'))
tod = Seurat::Read10X(file.path(tmpDir,'raw_gene_bc_matrices','GRCh38'))
sc = SoupChannel(tod,toc)
sc = setContaminationFraction(sc,0.2)
sc = autoEstCont(sc,priorRhoStdDev=0.3)

#https://rdrr.io/cran/SoupX/f/vignettes/pbmcTutorial.Rmd

其实这个曲线可以告诉我们的信息还有很多，特别当我们看到更多类型的数据时，细胞系样本，细胞核样本，肿瘤样本，发育样本，小鼠模型样本，等等，它的形状可能也会大有不同。

细胞系样本的曲线一般会更加的平滑，这里反映的是样本类型，细胞状态。

提到细胞状态，在做单细胞数据过滤的时候，另一个经常被提及的是线粒体基因，它用来表征细胞的应激状态，在以PBMC为示例的教程里线粒体含量过滤的阈值为>5%。这一数值经常被不假思索地用到其他组织类型中。

而只要我们稍加思索就会理解，线粒体作为细胞的动力工厂，其基因的表达在不同组织中是不同的。2018年发表在《Nature Communication》上的文章"The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes"对不同组织中的线粒体的表达情况进行了统计，发现不同的组织中的线粒体含量有着明显的差异，在心脏，肾脏，大脑等组织中线粒体基因表达比较量比较高。

不管是灰色曲线下barcode还是线粒体含量，抑或是umi数量，当我们执行subset过滤单细胞数据时，被过滤掉的那部分细胞，被打入冷宫，没有人问过它们过的怎么样。

每一次用subset这种函数去过滤细的时候，理应做好两方面工作，一方面是考虑保留下来这些细胞是什么，有什么规律，有什么样的轨迹，另方面要考被去掉这些细胞有什么样的生物信息，以避免过滤掉一些可能会被忽略的生物信息，以后再想找可能就找不回来了。

我们当然希望用于生物学发现的数据是清洁的、整洁的、不可置疑的，鉴于组织类型的异质性，在每一次执行subset的时候，我们还是要审慎地对待，避免取之尽锱铢，用之如泥沙的荒唐。

是考题就有喜欢和不喜欢的，我们可以先做喜欢的，而不能忽略不喜欢的，不要忽视你不愿看到的单细胞数据，那里可能蕴含着一篇CNS。