测序知识

第一第二代测序技术以PDF形式呈现

重点关注：illuminat测序平台的测序原理（怎么测，怎么分析）

第三代测序技术

第三代测序的发展方向太多，不好直接概括为某一特定方法。

在第二代测序的基础上，希望提高测序效率、提高测序通量、提高测序准确率、避免PCR扩增和避免荧光检测等等。

以PacBio公司的实时单分子测序SMRT和Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术为标志

不需要经过PCR扩增，超长读长，可达二代测序的100倍以上，实现了对每一条DNA分子的单独测序。错误率比二代要高，达到10-15%。

一些有代表性的公司和技术

Pacific BioSciences公司的实时单分子测序（real-time single-molecule）和complete genomics公司的复合探针-锚定连接技术（combinatorial probe-anchor ligation，cPAL），都依靠荧光检测来测序，但他们提高的是测序速度和通量；

Life technologies公司的离子流探测测序设备（Ion torrent）使用离子流场效应半导体感应器（ion-sensitive field effect transistor）,依靠边合成边测序的中心概念，检测每次添加碱基时候释放出的离子流，从而避免了传统第二代的荧光检测；

Oxford nanopore公司的纳米孔单分子测序技术，同样也避免了荧光检测和对主体DNA序列的PCR扩增。

PacBio 实时单分子测序

*中心思想：边合成边测序

*四种分别荧光标记的dNTPs参与到DNA聚合酶主导的链合成反应中，每类碱基在被添加上去的时候，会显示不同的荧光。当把这个链合成反应控制在一个DNA母板链、一个DNA聚合酶，一个相对封闭的反应空间的时候，就可以方便地对每次加入的荧光进行判别。

*PacBio公司采用零模波导纳米孔（zero-mode waveguide nanostructure）来盛装单一的链合成反应，每次被激发的散射光会被收集并分析波长，以判断荧光颜色，进而推断出碱基类型。

（图片来自网络）

Complete Genomics公司的复合探针-锚定连接技术

类似于升级版的SOLiD系统，但比之更复杂，一次性结合9个碱基，只有第五个碱基是确定的A、T、C或G，而其他8个碱基则是随机的。所以每个探针的长度是9个碱基，荧光种类还是4种，由每个探针的第五个碱基的种类确定。

整个反应的流程，从制备DNA库开始，到形成环状DNA样板，再到构建纳米级的锚定位列，最后测序分析。

一段长400bp的DNA片段被添加了四种特定序列，整个区域被分成八块，这样的细分可以方便后来在硅板上的特定结合和细化的测序。

纳米位列整合，每个点都有结合一个与其他纳米点不一样的短链DNA锚，可以方便环状DNA片段的特异性结合。

探针与锚定的环状DNA特异性结合，采集荧光，分析序列，即cPAL技术。

Oxford Nanopore 纳米孔单分子通道技术

纳米孔技术的基本原理是探测电信号而不是荧光信号。

该技术的核心是设计出了可以允许单个碱基通过的蛋白纳米通道，每种碱基通过通道的时候会对通道内的电流和通道两侧的电压产生不同的微小影响。采用灵敏的电子设备可以检测到这些变化，进而判断出通过纳米通道的碱基类型。

Nanopore的理念是Lab-on-Chip，所以他们一直致力于单分子的测序的研发，也算是第三代测序技术中突破传统，打开新理念的一种。

Ion Torrent电子流检测技术

新一代测序技术中并不用到荧光检测的一种，它检测的是在合成过程中不同碱基加入而释放出的不同强弱的离子流

一二三代测序技术的比较

（图片引自生信星球公众号）