单细胞｜RNA-seq & ATAC-seq 联合分析

数据科学工厂

发布于 2024-06-18 14:14:37

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发布于 2024-06-18 14:14:37

引言

本文[1]将介绍如何利用Signac和Seurat这两个工具，对一个同时记录了DNA可接触性和基因表达的单细胞数据集进行综合分析。我们将以一个公开的10x Genomics Multiome数据集为例，该数据集针对的是人体的外周血单核细胞。

数据准备

library(Signac)
library(Seurat)
library(EnsDb.Hsapiens.v86)
library(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38)

# load the RNA and ATAC data
counts <- Read10X_h5("../vignette_data/multiomic/pbmc_granulocyte_sorted_10k_filtered_feature_bc_matrix.h5")
fragpath <- "../vignette_data/multiomic/pbmc_granulocyte_sorted_10k_atac_fragments.tsv.gz"

# get gene annotations for hg38
annotation <- GetGRangesFromEnsDb(ensdb = EnsDb.Hsapiens.v86)
seqlevels(annotation) <- paste0('chr', seqlevels(annotation))

# create a Seurat object containing the RNA adata
pbmc <- CreateSeuratObject(
  counts = counts$`Gene Expression`,
  assay = "RNA"
)

# create ATAC assay and add it to the object
pbmc[["ATAC"]] <- CreateChromatinAssay(
  counts = counts$Peaks,
  sep = c(":", "-"),
  fragments = fragpath,
  annotation = annotation
)

pbmc

质控

我们可以通过DNA可及性数据来评估每个细胞的质量控制指标，并排除那些指标异常的细胞。此外，对于那些在RNA或ATAC检测中计数特别低或特别高的细胞，我们也会进行剔除。

DefaultAssay(pbmc) <- "ATAC"

pbmc <- NucleosomeSignal(pbmc)
pbmc <- TSSEnrichment(pbmc)

对象数据中变量之间的相互关系可以通过 DensityScatter() 函数来直观展示。此外，设置 quantiles=TRUE 选项，可以帮助我们迅速确定不同质量控制指标的适宜阈值。

DensityScatter(pbmc, x = 'nCount_ATAC', y = 'TSS.enrichment', log_x = TRUE, quantiles = TRUE)

VlnPlot(
  object = pbmc,
  features = c("nCount_RNA", "nCount_ATAC", "TSS.enrichment", "nucleosome_signal"),
  ncol = 4,
  pt.size = 0
)

# filter out low quality cells
pbmc <- subset(
  x = pbmc,
  subset = nCount_ATAC < 100000 &
    nCount_RNA < 25000 &
    nCount_ATAC > 1800 &
    nCount_RNA > 1000 &
    nucleosome_signal < 2 &
    TSS.enrichment > 1
)
pbmc

基因表达数据处理

我们可以使用 SCTransform 对基因表达数据进行标准化，并使用 PCA 降低维度。

DefaultAssay(pbmc) <- "RNA"
pbmc <- SCTransform(pbmc)
pbmc <- RunPCA(pbmc)

DNA可及性数据处理

在这里，我们通过执行潜在语义索引 ( LSI )，以处理 scATAC-seq 数据集的相同方式处理 DNA 可及性检测。

DefaultAssay(pbmc) <- "ATAC"
pbmc <- FindTopFeatures(pbmc, min.cutoff = 5)
pbmc <- RunTFIDF(pbmc)
pbmc <- RunSVD(pbmc)

注释细胞类型

为了注释数据集中的细胞类型，我们可以使用 Seurat 包中的工具，将细胞标签从现有的 PBMC 参考数据集中转移过来。

我们将使用 Hao 等人（2020年）的注释 PBMC 参考数据集，可以从这里下载：https://atlas.fredhutch.org/data/nygc/multimodal/pbmc_multimodal.h5seurat

请注意，加载参考数据集需要安装 SeuratDisk 包。

library(SeuratDisk)

# load PBMC reference
reference <- LoadH5Seurat("../vignette_data/multiomic/pbmc_multimodal.h5seurat", assays = list("SCT" = "counts"), reductions = 'spca')
reference <- UpdateSeuratObject(reference)

DefaultAssay(pbmc) <- "SCT"

# transfer cell type labels from reference to query
transfer_anchors <- FindTransferAnchors(
  reference = reference,
  query = pbmc,
  normalization.method = "SCT",
  reference.reduction = "spca",
  recompute.residuals = FALSE,
  dims = 1:50
)

predictions <- TransferData(
  anchorset = transfer_anchors, 
  refdata = reference$celltype.l2,
  weight.reduction = pbmc[['pca']],
  dims = 1:50
)

pbmc <- AddMetaData(
  object = pbmc,
  metadata = predictions
)

# set the cell identities to the cell type predictions
Idents(pbmc) <- "predicted.id"

# remove low-quality predictions
pbmc <- pbmc[, pbmc$prediction.score.max > 0.5]

联合 UMAP 可视化

使用 Seurat v4 中的加权最近邻方法，我们可以计算代表基因表达和 DNA 可及性测量的UMAP图。

# build a joint neighbor graph using both assays
pbmc <- FindMultiModalNeighbors(
  object = pbmc,
  reduction.list = list("pca", "lsi"), 
  dims.list = list(1:50, 2:40),
  modality.weight.name = "RNA.weight",
  verbose = TRUE
)

# build a joint UMAP visualization
pbmc <- RunUMAP(
  object = pbmc,
  nn.name = "weighted.nn",
  assay = "RNA",
  verbose = TRUE
)

DimPlot(pbmc, label = TRUE, repel = TRUE, reduction = "umap") + NoLegend()

将峰与基因联系起来

为了找到可能调控每个基因的峰值集合，我们可以计算基因表达与其附近峰值可及性之间的相关性，并校正由于 GC 含量、整体可及性和峰值大小引起的偏差。

在整个基因组上执行这一步骤可能非常耗时，因此我们在这里以部分基因为例，展示峰-基因链接。通过省略 genes.use 参数，可以使用相同的函数来找到所有基因的链接：

DefaultAssay(pbmc) <- "ATAC"

# first compute the GC content for each peak
pbmc <- RegionStats(pbmc, genome = BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38)

# link peaks to genes
pbmc <- LinkPeaks(
  object = pbmc,
  peak.assay = "ATAC",
  expression.assay = "SCT",
  genes.use = c("LYZ", "MS4A1")
)

我们可以使用 CoveragePlot() 函数可视化这些链接，或者我们可以在交互式分析中使用 CoverageBrowser() 函数：

idents.plot <- c("B naive", "B intermediate", "B memory",
                 "CD14 Mono", "CD16 Mono", "CD8 TEM", "CD8 Naive")

p1 <- CoveragePlot(
  object = pbmc,
  region = "MS4A1",
  features = "MS4A1",
  expression.assay = "SCT",
  idents = idents.plot,
  extend.upstream = 500,
  extend.downstream = 10000
)

p2 <- CoveragePlot(
  object = pbmc,
  region = "LYZ",
  features = "LYZ",
  expression.assay = "SCT",
  idents = idents.plot,
  extend.upstream = 8000,
  extend.downstream = 5000
)

patchwork::wrap_plots(p1, p2, ncol = 1)