可抑制癌细胞增殖！慧湖药学院联手天津医科大，研发新型肿瘤抑制蛋白降解剂 dp53m

编辑：李宝珠，三羊

dp53m 可特异性识别突变 p53-R175H 蛋白，实现目标蛋白的靶向降解。进而抑制突变 p53 蛋白功能性表达，实现抗肿瘤功效，且无明显毒性反应。

或许很多人不知道，其实我们每个人体内都存在癌细胞。人体每天都在进行着数十亿甚至上百亿细胞的新生与更替，在这个代谢过程中，DNA 复制难免会「出错」，比如会出现基因突变，让正常的细胞变成原位癌细胞。不过，人体内存在一些肿瘤抑制蛋白，如 p53，这些蛋白质可以通过调节细胞周期，促使癌细胞出现凋亡或衰老，从而遏止癌症的发生，这也是我们大多数人能与癌细胞「和平共处」的一个重要原因。

被称为「基因组守护者」的肿瘤抑制蛋白 p53 由基因 TP53 编码而来，在避免癌症发生机制上扮演着重要的角色。然而，TP53 会在 R175、G245、R248、R273 和 R282 等几种常见的特定热点处发生错义突变，进而产生 p53 突变体，导致正常肿瘤抑制蛋白功能的丧失。此外，由于部分 p53 突变体的显性负效应，不仅会让突变型 p53 失去其原有的肿瘤抑制功能，还会干扰正常野生型 p53 (p53-WT) 的肿瘤抑制活性，从而增加了肿瘤发生的风险。

与其他几种 p53 突变体相比，突变 p53-R175H 蛋白有更高肿瘤发生、转移和耐药性的可能。通过研发靶向 p53-R175H 药物，让靶向药物精准识别并对 p53-R175H 进行降解是抑制癌症发生的一种有效策略。然而，由于大多数突变 p53 蛋白缺乏小分子药物活性位点，设计能够精确识别并影响突变 p53 蛋白的靶向药物变得极为困难。

对此，西交利物浦大学慧湖药学院吴思晋教授联合天津医科大学总医院谢松波教授、钟殿胜教授团队，在 Elsevier 上发表了题为「An engineered DNA aptamer-based PROTAC for precise therapy of p53-R175H hotspot mutant-driven cancer」的论文。

本研究研发了一种具有选择性的 p53-R175H 降解剂——dp53m，该降解剂可以特异性识别突变 p53-R175H 蛋白，并利用细胞内天然的蛋白降解体系——泛素蛋白酶系统，实现目标蛋白的靶向降解，抑制突变 p53 蛋白的功能性表达。

该降解剂具有显著的抗肿瘤功效，且无明显毒性反应。此外，dp53m 还能与化疗药物顺铂发挥协同作用，增强癌细胞对顺铂的敏感性，对癌症的治疗至关重要。

研究亮点：

* 研究人员在 MD 模拟的指导下修饰非核心碱基，通过迭代分子对接引导 post-SELEX 法，将 RNA 适配体引导为 DNA 适配体 (p53m-DA)

* 作为 dp53m 的组成部分，p53m-DA 可特异性识别 p53-R175H 蛋白，CRBN 参与蛋白质降解过程，故 dp53m 可特异性识别 p53-R175H 蛋白，并对其进行降解

论文地址：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38811338/

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Post-SELEX 工程改造：构建能够特异性识别突变型 p53-R175H 的高性能 DNA 适配体

在对 p53 的研究中，研究者已发现 R175H 突变通过改变 p53 的结构状态，从而影响 DNA 结合功能，多种抑制剂小分子和适配体的结合能够部分恢复 p53-R175H 的活性，但其影响的分子机制未见报道。

本研究首先利用分子模拟方法挖掘了适配体恢复 p53-R175H 功能的内在分子机制。相较于正常 p53-WT，在突变 p53-R175H 中，L3 与 C-helix 之间的距离更近，L2 和 L3 之间的距离更大，这些位置的结构变化可能是导致 p53-R175H 突变体失去其典型功能的主要原因，也为其适配体和相关 PROTAC 分子的特异性识别提供了结构基础。

* 利用分子模拟方法预测p53m-RA的结构及其与p53-R175H蛋白的相互作用

* 结合界面在区域a和b中显示

在之前的研究中，靶向 p53-R175H 的 RNA 适配体 (p53m-RA ) 已被证实对 p53-R175H 有很高的亲和力，然而它在血清中很不稳定，这限制了其实际应用。

参考来源：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9884801/

* Post-SELEX优化的p53m-DA及其与p53-R175H的相互作用

* 结合界面在区域a、b、c中

为了增强适配体的结构稳定性和亲和力，研究人员在 MD 模拟的指导下修饰非核心碱基，通过 post-SELEX 将 RNA 适配体工程化为 DNA 适配体 (p53m-DA)。

*本研究分子模拟的算力由 OpenBayes 提供

结果表明，p53m-DA 配对区的结构表现为大沟，未配对的环区是小沟。大沟在与 L2 中 H178、H179、E171 和 Q167 的结合中起关键作用，小沟在与 L3 中 N247、R248、R249 的相互作用中起关键作用。此外，p53m-DA 在整个模拟过程中持续保持双链螺旋构象，这表现了其结构的稳定性。 *L2、L3 是存在于突变蛋白中的区域

突变p53-R175H蛋白对p53m-RA和p53m-DA的亲和力

研究人员进一步评估了 p53m-DA 对 p53-R175H 的亲和力和选择性。MST 测定显示，p53m-DA 的 Kd 为 0.29 lmol/L，比 p53m-RA 低约 2 倍。

(f) p53m-DA 对 p53-WT 和 p53-R175H 的亲和力

(g) streptavidin pulldown 测定分析 p53m-DA 对 p53-R175H 的特异性结合

(h,i) 评估 p53m-DA 的血清稳定性，并测定 p53m-DA 的剩余量

此外，p53m-DA 对突变 p53-R175H 的亲和力比其对正常 p53-WT 的亲和力高 14 倍。在 streptavidin pulldown 测定中，p53m-DA 与 p53-R175H 特异性结合，而不与 p53-WT 相互作用，这表明了 p53m-DA 对 p53-R175H 的特异性。值得注意的是，p53m-DA 的血清稳定性得到了显著改善，96 小时后其降解量也最小。

综上，p53m-DA 是一个特异性和稳定性都很高的适配体。

dp53m：是一种具有特异性的 p53-R175H 降解剂

实验一：合成 dp53m

适配体 p53m-DA 的 5’ 端位于其与 p53-R175H 的结合位点之外，研究人员使用 click reaction 将炔基化沙利度胺（CRBN E3 连接酶的配体）缀合至 N3-p53m-DA 的 5’ 端，所得到的蛋白降解靶向嵌合体 PROTAC (命名为 dp53m) 能够选择性地结合 p53-R175 H。dp53m 结构见下图：

*PROTAC：由一个 E3 连接酶配体、一个靶向 POI 的配体和配体之间的化学连接链组成

(a) 利用蛋白质-蛋白质对接和分子动力学计算模拟dp53m的结构

下图：其与p53-R175H和CRBN的结合界面

实验二：dp53m 可特异性识别并降解突变 p53-R175H

用dp53m或对照组(control)处理H1299-p53-WT、H1299-p53-WT-R175H细胞后蛋白质变化比较

为了研究 dp53m 对 p53-R175H 的细胞特异性，研究人员将在 H1299 细胞中过表达的 p53-R175H 和 p53-WT 用 PBS 或 dp53m 处理 16 小时，并监测它们的蛋白质变化水平。结果表明，dp53m 显著降解 p53-R175H，但不降解 p53—WT。 *PBS 是磷酸盐缓冲生理盐水，用作对照组

用dp53m处理不同p53突变体转染H1299细胞的免疫印迹、定量分析

此外，研究人员还评估了 dp53m 对其他热点突变体如 Y220C、R175L、G245V、R248Q、R248W、R249S、R273H 和 R282W 的降解潜力。结果表明，dp53m 仅有效降解 p53-R175H，证明了其对 p53-R175H 降解的特异性。

与 p53WT 相比，dp53m 处理增加了p53-R175H 的多聚泛素化，又因为研究发现 dp53m 的降解作用可以被蛋白酶抑制剂 MG132、CRBN 配体或 CRBN-targeting siRNA 阻断，推测 dp53m 诱导 p53-R175H 的降解是通过泛素-蛋白酶体机制发生的。

综上，dp53m 是一个具有特异性的 p53-R175H 降解剂，其降解过程是通过泛素-蛋白酶体机制发生的。

dp53m 可抑制癌细胞增殖和迁移和肿瘤生长

实验一：dp53m 抑制 p53-R175H 导致的癌细胞增殖和迁移

研究人员用 PBS、p53m-DA 或 dp53 m 分别处理 H1299-p53-WT、H1299-p53-R175H、A549、Detroit 562 和 SKBR3 细胞，并对它们进行活力测定，观察细胞中的集落形成。

用PBS、p53m-DA或dp53m处理H1299-p53-WT、H1299-p53-R175H、A549、Detroit 562和SKBR3细胞的活力测定

* dp53m抑制H1299-p53-R175H、Detroit 562和SKBR3细胞中的集落形成

* 在H1299-p53-WT和A549细胞中未观察到显著作用

上图表明，dp53m 在表达 p53-R175H 的癌细胞（H1299-p53-R175H、Detroit 562 和 SKBR3）中表现出显著的增殖抑制效果，而在表达 p53-WT 的细胞时基本不受影响。这表明 dp53m 在携带 p53-R175H 突变的癌细胞中具有很好的治疗潜力。

实验二：dp53m 抑制 p53-R175H 导致的肿瘤在体内生长

(b) 肉眼观察到的治疗后孤立肿瘤外观

(c) 在指定时间测量的肿瘤体积

(d) 最终肿瘤重量的测定

研究人员将携带肿瘤的 BALB/c 小鼠随机分配到 3 个组，并对其静脉施用 p53m-DA、dp53m 或作为对照的盐水，与对照组或 p53m-DA 相比，dp53m 显著抑制了肿瘤生长。

(g) 定量分析

(h) 肿瘤样品中的 p53

如预期的，dp53m 有效地降低了肿瘤中 p53-R175H 的表达水平。

用PBS、p53m或dp53m处理的Detroit 562-bearing小鼠主要器官的组织学检查

上图，3 组小鼠之间的心、肝、肺、脾和肾组织的组织学之间没有明显差异，这表明体内不存在来自 dp53m 的毒性。

综上，dp53m 可抑制 p53-R175H 导致的肿瘤生长，且无明显毒性反应。

此外，考虑到突变 p53-R175H 与化疗药物如顺铂的耐药性相关，研究人员还分析了dp53m 对顺铂抗肿瘤活性的影响。结果表明，dp53m 和顺铂之间存在强协同相互作用，即 dp53m 可以增强 p53-R175H 癌细胞对顺铂的敏感性，这为癌症的治疗提供了一个「无敌搭档」。

抗癌防线的加固者，科学家们共筑希望之路

癌症作为一种因细胞生长失控而引发的疾病，其发病率随着全球老龄化、环境污染加剧、生活习惯改变而显著增加。据国际癌症研究机构 (IARC) 数据显示，全球癌症新增个案数目估计将由 2020 年约 1,929 万例上升至 2040 年约 3,023 万例，增幅达 56.7%。

在应对癌症的全球战役中，科研人员发挥着关键作用。本文研究中的 3 位通讯作者：西交利物浦大学慧湖药学院的吴思晋老师、天津医科大学总医院谢松波教授、钟殿胜教授就是这一领域的优秀代表。

其中，吴思晋老师专注于新型靶向药物研发，目前的研究重点是利用计算机辅助药物设计和发现，使用建模、药效团分析、对接和分子动力学 (MD) 等模拟方法来识别新型治疗药物。他在 2022 年的研究中发现 SOST 表达上调与乳腺癌患者预后不良相关，SOST 激活下游信号通路促进乳腺癌细胞增殖和骨转移。通过计算筛选，该研究确定了一种候选治疗化合物 S6，可以破坏 SOST 与 STAT3 的相互作用，以抑制 STAT3 磷酸化并减少乳腺癌骨转移。 论文地址：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36581888/

此外，谢松波教授的主要研究方向是靶向蛋白质降解和药物递送，他在 2023 年的研究中提出，通过将适配体作为「靶向弹头」，可以用一种新的策略来诱导「不可药用」蛋白质的降解。为了证实这一概念，研究人员选择致癌的核仁素 (NCL) 作为目标，最终生成了一系列 NCL 降解剂，且 dNCL#T1 以一种依赖泛素蛋白酶系统的方式诱导 NCL 降解，可以抑制 NCL 诱导的乳腺癌细胞增殖，该研究不仅为蛋白质的降解提供了新视角，还为开发针对癌症等疾病的治疗药物奠定了坚实基础。 论文地址：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36608275/

最后，钟殿胜教授在肺癌的早期诊断、化疗、靶向治疗和抗血管生成治疗等领域也进行了深入研究，先后发表学术论文 90 余篇。他在 2024 年的研究中发现 CBX4 通过上调 PHGDH 表达和丝氨酸生物合成，促进肺腺癌 (LUAD) 的增殖，同时通过抑制 ZEB2 转录来抑制 LUAD 转移。这个发现有助于理解 CBX4 与表观遗传因子之间的相互作用，为 LUAD 的潜在治疗途径提供了启示。 论文地址：

https://www.nature.com/articles/s41419-024-06745-z

除了吴思晋老师、谢松波教授和钟殿胜教授之外，还有许多默默奉献、不断努力的科学家和医生们，我们期待随着科技的不断进步，终有一天，癌症将不再是人类噩梦。