Mfuzz/ClusterGVis包时间(规律变化数据即可)序列分析学习和整理

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修改于 2024-09-01 15:25:31

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Mfuzz是一个用于时间序列/状态空间/规律变化数据聚类分析的 R 包，适用于生物信息学中的规律变化数据分析。以下是 Mfuzz 包的主要作用：

模糊聚类分析：Mfuzz 使用模糊 C 均值（Fuzzy C-Means）算法对数据进行聚类。这种方法允许数据点属于多个聚类，这对于生物学数据中常见的噪声和复杂性特别有用。
处理噪声和不确定性：与传统的硬聚类不同，Mfuzz 可以处理数据中的噪声和不确定性，通过为每个数据点分配不同聚类的隶属度，反映出其对多个聚类归属可能性。
分析时间序列数据：Mfuzz 特别适合时间序列数据(规律变化数据即可！)分析，如不同时间点或不同实验条件下的基因表达变化。它能够识别出数据中的趋势和模式，帮助研究者理解基因或样本在不同条件下的响应。
可视化工具：Mfuzz 提供了可视化功能，可以展示聚类结果、时间序列模式和聚类隶属度，有助于深入分析和解释聚类结果。
处理缺失数据：Mfuzz 能够处理数据集中存在的缺失值，使其在实际应用中更加灵活和鲁棒。

ClusterGVis设计用于对这类规律变化的数据结果进行可视化和解释，得到更加精美的图~

分析流程

1、导入

GSE142588：华蟾素/肝癌/不同时间点

rm(list = ls())
library(Mfuzz)
library(limma)
library(clusterProfiler)
library(ggplot2)
library(ggstatsplot)
library(tidyverse)

load("GSE142588.Rdata")

2、数据预处理

dat <- log2(edgeR::cpm(exp)+1)
dat[1:4,1:4]
#           GSM4232492 GSM4232493 GSM4232494 GSM4232495
# DDX11L1    0.3879564   0.335058  0.3866041  0.3941932
# WASH7P     4.0736755   4.082968  4.0682735  2.7459054
# MIR6859-1  0.2698618   0.335058  0.2062135  0.2105183
# WASH9P     1.2560585   1.104527  1.2213747  1.3023497
dim(dat)
# [1] 19524    16
table(Group)
# con H12 H24 
#   4   6   6 
identical(rownames(clinical),colnames(exp))
# [1] TRUE

# 修改表达矩阵的列名
colnames(dat) <- Group
colnames(dat)
#  [1] "con" "con" "con" "H12" "H12" "H12" "H24" "H24" "H24" "con" "H12" "H12" "H12" "H24" "H24"
# [16] "H24"

library(limma)
# limma::avereps：这是来自 limma 包的函数，avereps 用于对重复数据进行平均值计算。
# avereps 会根据指定的 ID 进行分组，并对相同 ID 的数据取平均值
avereps_df <- t(limma::avereps(t(dat) , ID = colnames(dat)))##对相同时间序列的表达值取平均
avereps_df[1:3,1:3]
#                 con       H12       H24
# DDX11L1   0.3882151 0.2560873 0.1818046
# WASH7P    4.0862767 2.7356243 3.1765777
# MIR6859-1 0.2544874 0.1306503 0.1723505
colnames(avereps_df)
# [1] "con" "H12" "H24"
save(avereps_df,file = 'avereps_df.Rdata')

最后可以看到，得到了3组数据，分别是对照组(0h), H12(12h)和H24(24h)。

3、正式分析

load(file = 'avereps_df.Rdata')
avereps_df[1:3,1:3]
colnames(avereps_df)
 
## 过滤----
# 去除表达量太低或者在不同时间点间变化太小的基因等步骤
# Mfuzz聚类时要求是一个ExpressionSet类型的对象，所以需要先用表达量构建这样一个对象。
eset <- new("ExpressionSet",exprs = avereps_df)
# 根据处理NA值或者根据标准差去除样本间差异太小的基因
eset <- filter.NA(eset, thres = 0.25)
eset <- fill.NA(eset, mode = 'mean')
eset <- filter.std(eset,min.std=0)
# 0 genes excluded.
eset
# ExpressionSet (storageMode: lockedEnvironment)
# assayData: 19524 features, 3 samples 
#   element names: exprs 
# protocolData: none
# phenoData: none
# featureData: none
# experimentData: use 'experimentData(object)'
# Annotation:  

## 标准化----
# 聚类时需要用一个数值来表征不同基因间的距离，Mfuzz中采用的是欧式距离，
# 由于普通欧式距离的定义没有考虑不同维度间量纲的不同，所以需要先进行标准化
eset <- standardise(eset)

## FCM聚类参数设定----
# Mfuzz中的聚类算法需要提供两个参数，
# 第一个参数为希望最终得到的聚类的个数，这个参数由分析者直接指定
# 第二个参数称之为fuzzifier值，用小写字母m表示，可以通过函数评估一个最佳取值
c <- 9
m <- mestimate(eset) #  评估出最佳的m值
clusters <- mfuzz(eset, c = c, m = m) # 聚类
# ### Soft clustering and visualisation
# cl <- mfuzz(yeastF,c=20,m=1.25)
# acore.list <- acore(yeastF,cl=cl,min.acore=0.7)
#  }
# 开发者的示例参数

## 查看结果----
# 在clusters这个对象中就保存了聚类的完整结果，对于这个对象的常见操作如下
clusters$size # 查看每个cluster中的基因个数
# [1] 1641 1476  896 3097 2451 2035 2208 3606 2114
head(clusters$cluster[clusters$cluster == 1]) # 提取某个cluster下的基因
# LINC01128     NOC2L  C1orf159  C1QTNF12      NADK       SKI 
#         1         1         1         1         1         1 

## 聚类核心
#隶属度值也可以表示向量之间的相似性。
eset

## 提取形成软聚类簇α核心的基因
clusters_genes <- acore(eset,cl,min.acore=0.5)  
head(clusters_genes[[1]])
#              NAME  MEM.SHIP
# C1orf159 C1orf159 0.5048771
# TAS1R1     TAS1R1 0.7383337
# DDI2         DDI2 0.7399099
# CAMK2N1   CAMK2N1 0.6766280
# ECE1         ECE1 0.7718505
# HTR1D       HTR1D 0.5022669

table(clusters$cluster)
#    1    2    3    4    5    6    7    8    9 
# 1641 1476  896 3097 2451 2035 2208 3606 2114 
unlist(lapply(clusters_genes, nrow))
# [1]  335  273  135  953  641  528  529 1416  602

在实际分析数据的过程中，最关键的步骤应当是C和M值的选择。开发者也在文档中承认这两个值需要花很多功夫去确定，这也是这个R包中的缺点，但是做科研嘛~ 可不能怕麻烦的hhhh

那么简单介绍一下m和c值

具体内容一定要看原始文档，毕竟笔者也只是按照个人理解结合一些工具做的简单解释！

聚类参数的确定

FCM 参数 m 是一个关键参数，它决定了聚类分析对噪声的敏感性。当 m 接近 1 时，聚类会变得“hard”，即 FCM 算法变得与 K-means 聚类相似，此时隶属度(Membership value)值要么是 1，要么是 0，所有基因在计算聚类中心时被平等对待。随着参数 m 的增大，低隶属度的基因对聚类中心的影响会减弱。含有大量噪声的基因表达向量通常具有较低的隶属度，因为这些基因无法很好地被单个聚类表示，而是被分配给多个聚类。因此，选择 FCM 参数 m 可以控制噪声对聚类过程的影响。当 m 趋向于无穷大时，分区矩阵变得均匀，即所有基因几乎均等地分配到所有聚类中。通过观察不同 m 值下的聚类结果，可以深入了解数据结构。

基线聚类的构建

"hard"聚类算法（如 K-means 或 SOMs）一个主要问题是，无论数据如何，这些算法都会将对象分配到聚类中。即使数据是随机的，也会形成明显的聚类。通过"soft"聚类可以克服硬聚类中的这种缺陷(笔者认为应是减弱)。

聚类数量的确定

在选择 FCM 参数 m 之后，需要确定聚类的数量 c。FCM 算法中的聚类数 c 被逐渐增加，并对聚类结果进行了检查。观察到，随着 c 的增加，基因的隶属值在各个聚类之间更加分散，生成的聚类也变得更加相似。最终，会生成一些聚类，其中没有任何基因的隶属值超过 0.5(这个值应该是可以斟酌的)，就称这些为“空聚类”，因为没有基因主要被分配到这些聚类。空聚类的出现为设置 c 提供了依据。通过 FCM 进行的"soft"聚类反复执行，并监测非空聚类的数量, 并最终确定c值。

4.查看集群之间的耦合情况

overlap_clusters <- overlap(clusters)
pdf('mfuzz_overlap_plot.pdf',height = 4,width = 5)
p_overlaps <- overlap.plot(clusters, over = overlap_clusters, thres = 0.05)
p_overlaps
dev.off()

overlap(clusters)

这一步是计算聚类之间的重叠程度。overlap() 函数分析不同聚类之间的基因隶属度，以识别哪些基因在多个聚类中具有较高的隶属度。通过计算重叠，可以评估聚类的独立性和相似性，发现哪些聚类之间存在较大的交集。这对于理解数据结构中的复杂关系非常重要。

overlap.plot

overlap.plot() 是一个可视化工具，用于展示聚类之间的重叠关系。在图中，每个节点代表一个聚类，节点之间的连线表示重叠关系，线条的粗细通常反映了重叠的程度。这里的 thres = 0.05 是一个阈值，用于筛选显示的重叠程度。只有重叠度大于 0.05 的聚类对才会被显示，这样可以突出重要的聚类关系，避免图形过于复杂。

5.可视化

library(RColorBrewer)
color.2 <- colorRampPalette(rev(c("#ff0000", "Yellow", "OliveDrab1")))(1000)
pdf('mfuzz_clusters_plot.pdf',height = 7,width = 12)
mfuzz.plot(eset,clusters,mfrow=c(3,3),
           new.window= FALSE,
           time.labels= colnames(eset) ,
           colo = color.2)
dev.off()

pdf('mfuzz_clusters_plot01.pdf',height = 7,width = 12)
mfuzz.plot2(eset, clusters, mfrow = c(3, 3),
            centre = T, 
            x11 = F, 
            centre.lwd = 0.2)
dev.off()

不同cluster的基因群随着时间变化的趋势变化~

ClusterGVis试一试

1、getClusters 选择聚类个数

用的同一批数据,直接进入分析。

library(ClusterGVis)
load(file = 'avereps_df.Rdata')

# getClusters 函数计算均方和, 用户可根据拐点确定最佳聚类个数, 首先加载测试数据:
getClusters(exp = avereps_df)
# Warning message:
# Quick-TRANSfer stage steps exceeded maximum (= 976200)

可根据拐点确定最佳聚类个数，也可以结合热图结果进行选择最佳的数量。

2、clusterData 聚类

为了跟上面数据统一，cluster设置为9

# mfuzz
cm <- clusterData(exp = exps,
                  cluster.method = "mfuzz",
                  cluster.num = 9)

# kmeans
ck <- clusterData(exp = exps,
                  cluster.method = "kmeans",
                  cluster.num = 9)

3、visCluster 绘图

mfuzz/kmean结果

# plot line only
visCluster(object = cm,
           plot.type = "line")

# change color
visCluster(object = cm,
           plot.type = "line",
           ms.col = c("green","orange","red"))

# remove meadian line
visCluster(object = cm,
           plot.type = "line",
           ms.col = c("green","orange","red"),
           add.mline = FALSE)
           
# kmean结果
# plot line only with kmeans method
visCluster(object = ck,
           plot.type = "line")

展示一张

3.1 热图

# plot heatmap only
visCluster(object = ck,
           plot.type = "heatmap")

# supply other aruguments passed by Heatmap function
visCluster(object = ck,
           plot.type = "heatmap",
           column_names_rot = 45)

# change anno bar color
visCluster(object = ck,
           plot.type = "heatmap",
           column_names_rot = 45,
           ctAnno.col = ggsci::pal_npg()(8))

# add line annotation
pdf('testHT.pdf',height = 10,width = 6)
visCluster(object = ck,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45)
dev.off()


# add boxplot
pdf('testbx.pdf',height = 10,width = 6)
visCluster(object = ck,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           add.box = T)
dev.off()

# remove line and change box fill color
pdf('testbxcol.pdf',height = 10,width = 6)
visCluster(object = ck,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           add.box = T,
           add.line = F,
           boxcol = ggsci::pal_npg()(8))
dev.off()


# add point
pdf('testbxcolP.pdf',height = 10,width = 6)
visCluster(object = ck,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           add.box = T,
           add.line = F,
           boxcol = ggsci::pal_npg()(8),
           add.point = T)
dev.off()

# load term info
data("termanno")

# check
head(termanno,4)
#   id                               term
# 1 C1              developmental process
# 2 C1   anatomical structure development
# 3 C1 multicellular organism development
# 4 C2                 system development

# anno with GO terms
pdf('testHTterm.pdf',height = 10,width = 10)
visCluster(object = ck,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           annoTerm.data = termanno)
dev.off()


# change the line annotation side
pdf('testHTtermCmls.pdf',height = 10,width = 10)
visCluster(object = cm,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           annoTerm.data = termanno,
           line.side = "left")
dev.off()

展示一张

3.2还可以增加富集情况

具体不演示了

# load term info
# data("termanno")
# head(termanno,4)

# anno with GO terms
pdf('testHTterm.pdf',height = 10,width = 10)
visCluster(object = ck,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           annoTerm.data = termanno)
dev.off()


# change the line annotation side
pdf('testHTtermCmls.pdf',height = 10,width = 10)
visCluster(object = cm,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           annoTerm.data = termanno,
           line.side = "left")
dev.off()

# remove tree
pdf('testHTtermCmlsrt.pdf',height = 10,width = 10)
visCluster(object = cm,
           plot.type = "both",
           column_names_rot = 45,
           annoTerm.data = termanno,
           line.side = "left",
           show_row_dend = F)
dev.off()

说实话这个R包真的是好用呀！！

参考资料：

1、Mfuzz：

Mfuzz: a software package for soft clustering of microarray data. Bioinformation. 2007 May 20;2(1):5-7. doi: 10.6026/97320630002005

https://www.rdocumentation.org/packages/Mfuzz/versions/2.32.0/topics/acore

http://mfuzz.sysbiolab.eu/

https://bioconductor.org/packages/release/bioc/manuals/Mfuzz/man/Mfuzz.pdf

2、生信技能树： https://mp.weixin.qq.com/s/EyiVXem3T_53wQMG3vRNNw https://mp.weixin.qq.com/s/kwSz5N1C0UcksFyWDXF6Ew

3、老俊俊的生信笔记： https://mp.weixin.qq.com/s/lL3v_OdOEdwrOuwchsgaFA https://mp.weixin.qq.com/s/9tv2CFI2BtYbV7j9_RYwgQ https://mp.weixin.qq.com/s/-uKyeovFaF0NFvxhxxYAwA

4、小明的数据分析笔记本 https://cloud.tencent.com/developer/article/1845577

5、ClusterGVis:

https://github.com/junjunlab/ClusterGVis

致谢：感谢曾老师以及生信技能树团队全体成员。

注：若对内容有疑惑或者有发现明确错误的朋友，请联系后台(欢迎交流)。更多内容可关注公众号：生信方舟 - END -

原创声明：本文系作者授权腾讯云开发者社区发表，未经许可，不得转载。

如有侵权，请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除。

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