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社区首页 >专栏 >单细胞组间比较分析

单细胞组间比较分析

作者头像
用户11414625
发布于 2024-12-20 07:34:12
发布于 2024-12-20 07:34:12
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文章被收录于专栏：生信星球520生信星球520
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这篇文章介绍的是有分组的单细胞数据怎样分析，数据来自GEO的GSE231920，有3个treat，3个control样本，代码完整，可以自行下载数据跑一跑，但请注意细胞数量是6w，对计算资源要求较高，自己的电脑跑不动，需要在服务器上跑。

1.整理数据

因为数据组织的不是每个样本一个文件夹的形式，所以需要自行整理，参考代码如下，注意这段改名的代码不要反复运行：

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#untar("GSE231920_RAW.tar",exdir = "GSE231920_RAW")
#unlink("GSE231920_RAW.tar")
library(stringr)
fs = paste0("GSE231920_RAW/",dir("GSE231920_RAW/"))
fs
samples = dir("GSE231920_RAW/") %>% str_split_i("_",2) %>% unique();samples

#为每个样本创建单独的文件夹
lapply(samples, function(s){
  ns = paste0("01_data/",s)
  if(!file.exists(ns))dir.create(ns,recursive = T)
})

#每个样本的三个文件复制到单独的文件夹
lapply(fs, function(s){
  #s = fs[1]
  for(i in 1:length(samples)){
    #i = 1
    if(str_detect(s,samples[[i]])){
      file.copy(s,paste0("01_data/",samples[[i]]))
    }
  }
})

#文件名字修改
on = paste0("01_data/",dir("01_data/",recursive = T));on
nn = str_remove(on,"GSM\\d+_sample\\d_");nn
file.rename(on,nn)

代码主要参考：

https://satijalab.org/seurat/articles/integration_introduction

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rm(list = ls())

2.批量读取

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rm(list = ls())
library(Seurat)
f = dir("01_data/")
scelist = list()
for(i in 1:length(f)){
  pda <- Read10X(paste0("01_data/",f[[i]]))
  scelist[[i]] <- CreateSeuratObject(counts = pda, 
                                     project = f[[i]])
  print(dim(scelist[[i]]))
}

## [1] 33538 10218
## [1] 33538  8931
## [1] 33538  8607
## [1] 33538 12733
## [1] 33538 11038
## [1] 33538 10821

sce.all = merge(scelist[[1]],scelist[-1])
sce.all = JoinLayers(sce.all)
head(sce.all@meta.data)

##                      orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA
## AAACCCACACAAATAG-1_1    sample1       5624         1539
## AAACCCACAGGCTCTG-1_1    sample1      36854         1798
## AAACCCACAGGTCCCA-1_1    sample1       5659         1463
## AAACCCACAGTCGGTC-1_1    sample1       4243         1256
## AAACCCAGTTTGGCTA-1_1    sample1       5105         1563
## AAACCCATCCCATAAG-1_1    sample1       3817         1495

table(sce.all$orig.ident)

## 
## sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 sample6 
##   10218    8931    8607   12733   11038   10821

sum(table(Idents(sce.all)))

## [1] 62348

3.质控指标

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sce.all[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(sce.all, pattern = "^MT-")
sce.all[["percent.rp"]] <- PercentageFeatureSet(sce.all, pattern = "^RP[SL]")
sce.all[["percent.hb"]] <- PercentageFeatureSet(sce.all, pattern = "^HB[^(P)]")

head(sce.all@meta.data, 3)

##                      orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt percent.rp
## AAACCCACACAAATAG-1_1    sample1       5624         1539  6.4544808  34.726174
## AAACCCACAGGCTCTG-1_1    sample1      36854         1798  0.1438107   7.640962
## AAACCCACAGGTCCCA-1_1    sample1       5659         1463  3.4811804  30.040643
##                      percent.hb
## AAACCCACACAAATAG-1_1 0.00000000
## AAACCCACAGGCTCTG-1_1 0.00000000
## AAACCCACAGGTCCCA-1_1 0.01767097

VlnPlot(sce.all, 
        features = c("nFeature_RNA",
                     "nCount_RNA", 
                     "percent.mt",
                     "percent.rp",
                     "percent.hb"),
        ncol = 3,pt.size = 0, group.by = "orig.ident")
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sce.all = subset(sce.all,percent.mt<25)

4.整合降维聚类分群

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f = "obj.Rdata"
library(harmony)
if(!file.exists(f)){
  sce.all = sce.all %>% 
    NormalizeData() %>%  
    FindVariableFeatures() %>%  
    ScaleData(features = rownames(.)) %>%  
    RunPCA(pc.genes = VariableFeatures(.))  %>%
    RunHarmony("orig.ident") %>%
    FindNeighbors(dims = 1:15, reduction = "harmony") %>% 
    FindClusters(resolution = 0.5) %>% 
    RunUMAP(dims = 1:15,reduction = "harmony") %>% 
    RunTSNE(dims = 1:15,reduction = "harmony")
  save(sce.all,file = f)
}
load(f)
ElbowPlot(sce.all)
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UMAPPlot(sce.all,label = T)
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TSNEPlot(sce.all,label = T)

5.注释

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library(celldex)
library(SingleR)
ls("package:celldex")

## [1] "BlueprintEncodeData"              "DatabaseImmuneCellExpressionData"
## [3] "HumanPrimaryCellAtlasData"        "ImmGenData"                      
## [5] "MonacoImmuneData"                 "MouseRNAseqData"                 
## [7] "NovershternHematopoieticData"

f = "ref_HumanPrimaryCellAtlasData.RData"
if(!file.exists(f)){
  ref <- celldex::HumanPrimaryCellAtlasData()
  save(ref,file = f)
}
ref <- list(get(load("ref_BlueprintEncode.RData")),
            get(load("ref_HumanPrimaryCellAtlasData.RData")))
library(BiocParallel)
scRNA = sce.all
test = scRNA@assays$RNA$data
pred.scRNA <- SingleR(test = test, 
                      ref = ref,
                      labels = list(ref[[1]]$label.main,ref[[2]]$label.main), 
                      clusters = scRNA@active.ident)
pred.scRNA$pruned.labels

##  [1] "CD8+ T-cells"      "B-cells"           "Fibroblasts"      
##  [4] "CD4+ T-cells"      "CD8+ T-cells"      "Neutrophils"      
##  [7] "Endothelial_cells" "Fibroblasts"       "Monocytes"        
## [10] "Macrophages"       "Fibroblasts"       "Adipocytes"       
## [13] "B-cells"           "NK cells"          "Monocytes"        
## [16] NA                  "Endothelial cells" "Monocytes"        
## [19] "Neutrophils"       "Fibroblasts"       "Adipocytes"

#查看注释准确性 
#plotScoreHeatmap(pred.scRNA, clusters=pred.scRNA@rownames, fontsize.row = 9,show_colnames = T)
new.cluster.ids <- pred.scRNA$pruned.labels
new.cluster.ids[is.na(new.cluster.ids)] = "unknown"
names(new.cluster.ids) <- levels(scRNA)
levels(scRNA)

##  [1] "0"  "1"  "2"  "3"  "4"  "5"  "6"  "7"  "8"  "9"  "10" "11" "12" "13" "14"
## [16] "15" "16" "17" "18" "19" "20"

scRNA <- RenameIdents(scRNA,new.cluster.ids)
levels(scRNA)

##  [1] "CD8+ T-cells"      "B-cells"           "Fibroblasts"      
##  [4] "CD4+ T-cells"      "Neutrophils"       "Endothelial_cells"
##  [7] "Monocytes"         "Macrophages"       "Adipocytes"       
## [10] "NK cells"          "unknown"           "Endothelial cells"

p2 <- DimPlot(scRNA, reduction = "umap",label = T,pt.size = 0.5) + NoLegend()
p2

6.分组可视化及组件细胞比例比较

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scRNA$seurat_annotations = Idents(scRNA)
table(scRNA$orig.ident)

## 
## sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 sample6 
##   10109    8303    8510   12593   10874   10623

library(tinyarray)
pd = geo_download("GSE231920")$pd
pd$title

## [1] "IgG4-RD1" "IgG4-RD2" "IgG4-RD3" "Control1" "Control2" "Control3"

scRNA$group = ifelse(scRNA$orig.ident %in% c("sample1","sample2","sample3"), "treat","control")
DimPlot(scRNA, reduction = "umap", group.by = "group")

可以计算每个亚群的细胞数量和占全部细胞的比例

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# 每种细胞的数量和比例
cell_counts <- table(Idents(scRNA))
cell.all <- cbind(cell_counts = cell_counts, 
                  cell_Freq = round(prop.table(cell_counts)*100,2))
#各组中每种细胞的数量和比例
cell.num.group <- table(Idents(scRNA), scRNA$group) 
cell.freq.group <- round(prop.table(cell.num.group, margin = 2) *100,2)
cell.all = cbind(cell.all,cell.num.group,cell.freq.group)
cell.all = cell.all[,c(1,3,4,2,5,6)]
colnames(cell.all) = paste(rep(c("all","control","treat"),times = 2),
      rep(c("count","freq"),each = 3),sep = "_")
cell.all

##                   all_count control_count treat_count all_freq control_freq
## CD8+ T-cells          15077          5518        9559    24.71        16.19
## B-cells                9089          2870        6219    14.90         8.42
## Fibroblasts           12356         10773        1583    20.25        31.60
## CD4+ T-cells           7073          2303        4770    11.59         6.76
## Neutrophils            5513          4114        1399     9.04        12.07
## Endothelial_cells      3236          2360         876     5.30         6.92
## Monocytes              2948          1934        1014     4.83         5.67
## Macrophages            2093          1661         432     3.43         4.87
## Adipocytes             1468          1322         146     2.41         3.88
## NK cells               1200           695         505     1.97         2.04
## unknown                 531           186         345     0.87         0.55
## Endothelial cells       428           354          74     0.70         1.04
##                   treat_freq
## CD8+ T-cells           35.51
## B-cells                23.10
## Fibroblasts             5.88
## CD4+ T-cells           17.72
## Neutrophils             5.20
## Endothelial_cells       3.25
## Monocytes               3.77
## Macrophages             1.60
## Adipocytes              0.54
## NK cells                1.88
## unknown                 1.28
## Endothelial cells       0.27

7.差异分析

找某种细胞在不同组间的差异基因

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if(!require("multtest"))BiocManager::install('multtest')
if(!require("metap"))install.packages('metap')
table(scRNA$seurat_annotations)

## 
##      CD8+ T-cells           B-cells       Fibroblasts      CD4+ T-cells 
##             15077              9089             12356              7073 
##       Neutrophils Endothelial_cells         Monocytes       Macrophages 
##              5513              3236              2948              2093 
##        Adipocytes          NK cells           unknown Endothelial cells 
##              1468              1200               531               428

sub.markers <- FindConservedMarkers(scRNA, ident.1 = "NK cells", grouping.var = "group", min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25,verbose = F)
head(sub.markers)

##       treat_p_val treat_avg_log2FC treat_pct.1 treat_pct.2 treat_p_val_adj
## GNLY            0         6.695047       0.949       0.032               0
## KLRD1           0         5.818575       0.950       0.037               0
## GZMB            0         5.418138       0.909       0.039               0
## NKG7            0         4.850398       0.998       0.148               0
## PRF1            0         5.655445       0.897       0.054               0
## CTSW            0         4.974234       0.865       0.046               0
##       control_p_val control_avg_log2FC control_pct.1 control_pct.2
## GNLY              0           6.275650         0.944         0.036
## KLRD1             0           5.566265         0.961         0.041
## GZMB              0           5.895107         0.937         0.033
## NKG7              0           5.118054         1.000         0.103
## PRF1              0           5.515456         0.902         0.046
## CTSW              0           4.268425         0.919         0.094
##       control_p_val_adj max_pval minimump_p_val
## GNLY                  0        0              0
## KLRD1                 0        0              0
## GZMB                  0        0              0
## NKG7                  0        0              0
## PRF1                  0        0              0
## CTSW                  0        0              0

组间比较的气泡图

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markers.to.plot = c("CD3D", "CREM", "HSPH1", "SELL", "GIMAP5", "CACYBP", "GNLY", "NKG7", "CCL5",
    "CD8A", "MS4A1", "CD79A", "MIR155HG", "NME1", "FCGR3A", "VMO1", "CCL2", "S100A9", "HLA-DQA1",
    "GPR183", "PPBP", "GNG11", "HBA2", "HBB", "TSPAN13", "IL3RA", "PRSS57") #一组感兴趣的基因
#如果idents有NA会报错https://github.com/satijalab/seurat/issues/8772
#scRNA <- subset(scRNA, seurat_annotations %in% na.omit(scRNA$seurat_annotations))
DotPlot(scRNA, features = markers.to.plot, cols = c("blue", "red"), 
        dot.scale = 8, split.by = "group") +
    RotatedAxis()
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FeaturePlot(scRNA, features = c("CD3D", "GNLY", "IFI6"), split.by = "group", max.cutoff = 3, cols = c("grey",
    "red"), reduction = "umap")
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plots <- VlnPlot(scRNA, features = c("LYZ", "ISG15", "CXCL10"), split.by = "group", group.by = "seurat_annotations",
    pt.size = 0, combine = FALSE)
library(patchwork)
wrap_plots(plots = plots, ncol = 1)

8.伪bulk 转录组差异分析

每个组要有多个样本才能做

https://satijalab.org/seurat/articles/parsebio_sketch_integration

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bulk <- AggregateExpression(scRNA, return.seurat = T, slot = "counts", assays = "RNA", group.by = c("seurat_annotations","orig.ident", "group"))

sub <- subset(bulk, seurat_annotations == "CD8+ T-cells")
Idents(sub) <- "group"
de_markers <- FindMarkers(sub, ident.1 = "treat", ident.2 = "control", slot = "counts", test.use = "DESeq2",
    verbose = F)
de_markers$gene <- rownames(de_markers)
k1 = de_markers$avg_log2FC< -1 & de_markers$p_val <0.01
k2 = de_markers$avg_log2FC> 1 & de_markers$p_val <0.01
de_markers$change <- ifelse(k1,"down",ifelse(k2,"up","not"))
library(ggplot2)
library(ggrepel)
ggplot(de_markers, aes(avg_log2FC, -log10(p_val),color = change)) + 
  geom_point(size = 0.5, alpha = 0.5) + 
  geom_vline(xintercept = c(1,-1),linetype = 4)+
  geom_hline(yintercept = -log10(0.01),linetype = 4)+
  scale_color_manual(values = c("blue","grey","red"))+
  theme_bw() +
  ylab("-log10(unadjusted p-value)")
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