跟着Nature学细菌耐药基因分析：多药耐药葡萄球菌的基因特征分析

之前我们一起学习了一系列细菌耐药性分析的工具软件，有不少读者强烈希望后续能多分享点这方面的文章。今天我们就一起来解读下面这篇2024年底发表的Nature论文，学习其中的研究思路和生信分析方法。

这篇文章的生信分析部分用到了之前我们介绍过的mlst、 abricate、Prokka、IQ - Tree工具，这些工具都能在Galaxy生信云平台（网址：usegalaxy.cn )上方便地使用，不需要安装软件和配置复杂的环境，也无需下载大型的耐药基因数据库。有兴趣的读者可以参考以下文章：

多位点序列分型（MLST）：细菌分类的“DNA指纹”

ABRicate：轻松快速帮你完成细菌耐药基因及毒力基因鉴定

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一文详解细菌耐药性生信分析:从下机数据到耐药基因鉴定

下面，我们就跟随Nature的步伐，一步步拆解其研究脉络。

摘要：环境领域是抗菌药物耐药性出现和传播的关键场所。本研究对日本一国际机场公共区域进行环境监测，发现耐甲氧西林葡萄球菌在频繁接触表面的检出率达 46.3%，溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌是主要携带者，还发现一株含特定基因的家畜相关 MRSA 强毒株，其耐药机制多样。这揭示了公共卫生隐患，凸显分子监测的重要性。

关键词：耐甲氧西林葡萄球菌；mecA 基因；LA - MRSA；全基因组测序；公共区域；国际机场

一、引言

凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）是传染病中的棘手难题，作为机会致病菌和医院感染菌，引发多种临床病症，多药耐药菌株的出现使其所致感染愈发难治。金黄色葡萄球菌因毒力因子和毒素，也是重要病原体，其耐药性带来治疗困境。葡萄球菌对甲氧西林耐药常与 mecA 基因相关，该基因位于可移动遗传元件 SCCmec 上。MRSA 是全球性威胁，有医疗保健相关和社区相关类型，且家畜相关 MRSA 也引发关注。日本 MRSA 感染严重，非临床环境中也存在甲氧西林耐药情况。本研究旨在探究机场等非临床环境中耐甲氧西林葡萄球菌的情况，为防控提供依据。

二、结果

在机场人员协助下，2021 年 10 月从日本国际机场公共区域采集 41 份拭子样本，经多种选择性培养基筛选出 72 株菌株，其中 80%在 CHROMagar™ MRSA 培养基上生长且经确认对甲氧西林耐药。通过全基因组测序和系统发育分析，41 个样本中有 19 个（46.3%）含耐甲氧西林葡萄球菌，分属六个物种，主要是溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌（图 1）。

图 1

图1：本研究检测到的 20 株耐甲氧西林葡萄球菌菌株（红色）和来自 NCBI 数据库的 61 个代表性葡萄球菌基因组的核心基因组系统发育树。金黄色葡萄球菌分支以黄色突出显示。该树是通过与 IQ - Tree 进行核心基因组比对推断得出的。将溶葡萄球菌（Macrococcus caseolyticus，组装登录号：GCA_016028795.1）作为外群来确定树的根。将该树输入到 Interactive Tree Of Life（http://itol.em)bl.de）进行进一步注释。节点上的圆圈显示自展值。比例尺表示每个核苷酸位点的替换数。

多数耐甲氧西林菌株为溶血葡萄球菌，携带多种看家基因，部分菌株携带特定的 SCCmec 和 mec 基因复合物，mecA 和 blaZ 基因使菌株对多种β-内酰胺类抗生素耐药，还携带其他耐药基因，对不同抗生素表现出多样耐药性（图 2）。表皮葡萄球菌是第二大常见的耐甲氧西林 CoNS，携带相关基因和复合物，对多种抗生素耐药情况也各有不同。此外，还鉴定出其他耐甲氧西林 CoNS 菌株及对应的基因特征和耐药情况。

图 2

图 2：核心基因组系统发育树的修剪树，仅包含本研究收集的菌株。比例尺表示每个核苷酸位点的替换数。将本研究中鉴定的序列类型（ST）、葡萄球菌盒式染色体（SSCmec）和耐药基因数据集整合到树中。

研究还发现一株 MRSA 菌株（M26）为 LA - MRSA，具有特定基因型和多种毒力因子，携带特定 SCCmec、ccr 基因复合物和耐药基因，抗生素敏感性试验表明其具有多药耐药性，但对部分关键抗生素敏感。

三、讨论

本研究表明非临床环境中的耐甲氧西林 CoNS 意义重大，其在机场等场所的流行凸显了普遍性和适应性。溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌耐药性强，其基因特征增加了感染控制难度，未来需研究传播动态和防控策略。MRSA 对公共卫生威胁大，LA - MRSA CC398 引发关注，本研究菌株的基因特征表明其与人类感染有关，但仍需进一步确认。此类菌株的耐药性和生存能力给防控带来挑战，需加强监测和防控。本研究有局限性，无法确定耐药细菌来源和途径，且仅针对单一交通系统，后续需开展更全面研究。

四、方法

• • 采样和筛选：在机场授权人员协助下，用无菌棉拭子采集样本，置于特定拭子管中运至实验室，经培养后接种到多种显色琼脂培养基，根据颜色挑选疑似菌落并传代培养，进行抗生素耐药性确认。
• • 表型和基因型确认试验：使用 31 种抗生素面板在 MicroScan WalkAway 96 Plus 机器上测定 MIC 以确认耐甲氧西林菌株表型，同时进行联合纸片扩散试验（CDT）和改良碳青霉烯灭活法（mCIM）确认产 ESBLs 和碳青霉烯酶菌株表型；用特定 DNA 提取试剂盒提取 DNA，经 PCR 扩增和基因测序，使用 SnapGene® viewer 6.1 分析序列，与 NCBI 数据库比对，未检测到万古霉素耐药基因则无需基因组特征分析。
• • 全基因组测序和系统发育分析：借助日本国立传染病研究所进行全基因组测序，用 lysostaphin 和 Agencourt AMPure XP 提取基因组 DNA，在自动化样品制备系统上制备 DNA 文库，用 HiSeq X FIVE 平台测序，Shovill v1.0.9 组装读数；用 mlst v2.19.0 进行 MLST 分析，基因组流行病学中心网站服务注释序列，通过 abricate v1.0.1 程序中的 ResFinder 识别耐药和毒力基因，在基因组流行病学中心分析 SCCmec 分型；用 Bactopia v3 的泛基因组工作流程进行基因组注释、泛基因组分析和核心基因组系统发育树推断，涉及 Prokka、PIRATE、IQ - Tree 等工具，最后将树输入 Interactive Tree Of Life 并整合相关数据集。

数据可用性：本研究产生的全基因组序列读数已提交至日本 DNA 数据银行（DDBJ），BioProject accession number 为 PRJDB16040，菌株的 BioSample accession numbers 为 SAMD00623456 - SAMD00623476。