Nat. Commun. | 通过引入和利用转录因子结合单元（TFBU）对增强子进行建模与设计

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增强子在各种生物过程中通过与转录因子（TFs）相互作用，成为基因表达的关键调控元件。尽管转录因子结合位点（TFBSs）被广泛认为是决定TF结合和增强子活性的关键因素，但其周围的上下文序列在多大程度上影响TF结合及增强子活性仍未被量化。在本研究中，研究人员提出了转录因子结合单元（TFBU）的概念，以模块化方式建模增强子，并使用深度学习模型定量分析TFBS周围的上下文序列的影响。基于该概念，研究人员开发了DeepTFBU，一个用于增强子设计的综合工具包。研究结果表明，设计TFBS的上下文序列可以显著调控增强子活性，并产生细胞类型特异性响应。此外，DeepTFBU在从头设计（de novo design）包含多个TFBS的增强子方面表现出色，同时能够灵活地解耦和优化增强子。研究人员证明了TFBU是增强子建模和设计的关键概念，而DeepTFBU则是高效的理性增强子设计工具。

研究背景

基因表达的精确调控对发育和分化等复杂生物过程至关重要。其中，增强子通过结合转录因子（TFs）在基因调控中发挥核心作用。解析增强子活性的基本机制可以为基因调控的研究提供新见解，并促进合成增强子的设计，在基因工程和基因治疗中具有重要应用价值。传统观点认为，TF结合位点（TFBSs），特别是长约5-20个碱基的TF结合基序（motifs），是决定TF结合和增强子功能的关键因素。研究发现，DNA序列中多个TFBS的排列可以增强其作为增强子的功能，TFBS的方向性和排列顺序也对增强子活性有显著影响。因此，通过操控DNA序列上的TFBS组合已成为合成增强子设计的常用方法。

然而，尽管DNA序列中包含相同的TF结合基序，其TF结合行为仍可能因基因组环境的不同而表现出显著差异。这种变异性强调了TFBS周围上下文序列在决定TF结合效率和增强子活性中的关键作用。例如，短串联重复序列（short tandem repeats）可能直接与TF相互作用，充当“DNA天线”以吸引TF。此外，TF的无序区域（IDRs）有助于识别特定的上下文序列以促进TF结合。局部DNA形状、弱结合位点的存在以及上下文序列中的其他TFBS也可能共同影响TF结合。因此，仅关注TF结合基序的模型存在局限性，迫切需要一种量化方法来表征TFBS上下文对不同TFs和细胞类型的影响，以更好地理解基因调控机制，并理性设计具有特定功能的合成增强子。

为了解决上述挑战，本研究提出了转录因子结合单元（TFBU）的概念，用于模块化地对增强子进行建模和设计。TFBU的定义不仅包括核心TFBS，还包括其周围的上下文序列（TFBS-context）。该整合方法可用于定量评估长DNA序列的TF结合潜力，并预测其在特定细胞类型中的转录激活能力（增强子活性）。研究人员利用深度学习模型，从染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据中提取了影响TF结合的关键模式。这些模型能够理性设计合成增强子，扩展了从核心TFBS到整个增强子序列的设计范围。在此基础上，研究人员开发了一系列增强子设计方法，并将其整合进工具包DeepTFBU。

方法

TFBU 评分模型

研究人员使用深度学习模型分析TFBS及其上下文序列的影响。他们构建了TFBS-context评分模型，用于评估特定TF的结合偏好。该模型的输入是TFBS上下文序列的独热编码，并经过以下神经网络层处理：

• 1D卷积层（CNN）：提取局部序列模式。
• 双向LSTM层：捕捉上下文序列的长程依赖关系。
• 全连接层（Dense Block）：整合特征并输出TFBS-context匹配评分。

该模型利用ChIP-seq数据进行训练，以识别可促进TF结合的序列模式。研究人员从ENCODE数据库获取了198种TF在HepG2细胞系中的ChIP-seq数据，并构建了每种TF的TFBS-context数据集。

TFBU 设计与优化

研究人员开发了一种基于遗传算法（GA）的优化方法，用于设计TFBU序列：

• 初始化：随机生成DNA序列。
• 评分：使用TFBS-context模型计算匹配分数。
• 变异与重组：对序列进行随机突变和重组。
• 选择：保留得分较高的序列，进入下一轮优化。
• 迭代：经过多轮迭代后，得到优化的增强子序列。

研究人员使用该方法设计了超过36,000条增强子序列，并进行实验验证，结果表明：

• 设计的TFBS-context可以显著提高增强子活性，单个TFBU的平均活性提升可达20倍，最高可达60倍。
• TFBU方法可用于从头设计（de novo）增强子，使增强子活性提高30倍以上。
• 采用TFBU方法优化巨细胞病毒（CMV）增强子，仅通过少量突变便能提高其活性60%。

实验验证

研究人员通过大规模平行报告基因实验（MPRA）验证TFBU设计的增强子活性：

• 选取了ELF1、HNF1A、HNF4A等关键TF，在HepG2细胞中测试其TFBS和上下文序列的影响。
• 结果显示：

1. 优化的TFBS-context相比于基因组随机片段，增强子活性提高了3.3倍以上。
2. 不同TF的TFBS-context影响不同，TFBU方法适用于多种TF的增强子设计。
3. 设计的TFBU可生成细胞类型特异性增强子，在HepG2和K562细胞中表现出不同的增强子活性。

结论

• 提出了TFBU概念，用于模块化增强子建模。
• 证明了TFBS上下文序列可显著调控增强子活性。
• 设计的DeepTFBU工具包可用于增强子的理性设计。
• 成功优化了多个TF的增强子活性，并实现了细胞类型特异性增强子设计。
• 增强子可被解耦成TFBU模块，并可用于优化现有增强子。

这项研究展示了TFBU作为增强子设计的关键概念，并提供了一个强大的工具——DeepTFBU，可广泛应用于基因调控研究和合成生物学。