Nature | 全新设计的跨膜荧光激活蛋白

跨膜蛋白对生物膜内外的物质、能量和信息交换至关重要。尽管在 水溶性蛋白结合小分子 和 跨膜蛋白设计 上取得了一定进展，但 针对特定小分子的高亲和力、非共价结合的跨膜蛋白设计 仍然面临挑战。本研究中，研究人员通过 深度学习与能量优化方法相结合，准确设计了小分子结合跨膜蛋白。通过高质量四螺旋束 (four-helix bundle) 背骨预组织 配体结合口袋，并利用 梯度引导的幻觉 (gradient-guided hallucination) 方法生成 跨膜螺旋，成功设计了 高活性的跨膜荧光激活蛋白 (tmFAP)。这些 tmFAPs 能够特异性激活目标荧光配体 (HBC599)，显示出 中纳摩尔亲和力，并且 亮度和量子产率 显著高于 增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)。此外，这些蛋白在 细菌和真核细胞膜中 高度活跃，晶体结构和冷冻电镜 (cryo-EM) 结果与设计模型高度一致。本研究首次展示了非共价小分子结合跨膜蛋白的 de novo 精确设计，为 成像、配体感知和膜运输 等功能性跨膜蛋白的创造开辟了新路径。

背景与研究现状

跨膜蛋白是生物膜内外 物质、能量和信息交换 的核心介质。在 配体识别 和 信号传导 中起着至关重要的作用。随着 蛋白质结构预测和设计工具 的进步，如 AlphaFold 2 和 深度神经网络 的应用，人们在 水溶性蛋白结合小分子 和 跨膜蛋白设计 领域取得了显著进展。

然而，针对特定小分子的高亲和力、非共价结合的跨膜蛋白设计 仍面临巨大挑战。目前的 天然跨膜蛋白 中已知的结构和配体种类有限，而 de novo 跨膜蛋白设计 主要集中于 通过共价键结合配体 (如铁-组氨酸配位) 的领域，尚未出现针对特定小分子的非共价结合设计。

研究动机与挑战

• 非共价小分子-跨膜蛋白相互作用的精确设计是蛋白质工程领域的一项重大挑战；
• 需要克服以下技术难点：

1. 高精度配体结合口袋设计：要求高亲和力和特异性；

2. 跨膜蛋白的折叠与稳定性：跨膜螺旋与膜环境的相互作用会影响蛋白质的正确折叠和稳定性；

3. 非共价结合的特异性：设计的蛋白需能在 生理

膜环境 中展示高特异性和高活性。

研究目标

• 通过结合深度学习 (AlphaFold 2, ColabDesign) 和能量优化 (Rosetta)，设计具有 高活性和高特异性 的 荧光激活跨膜蛋白 (tmFAP)；
• 验证设计蛋白在 细菌和真核细胞膜中 的 荧光激活功能和结构稳定性；
• 证明 人工化学物质 (HBC599) 与跨膜蛋白在膜环境中 的 非共价相互作用 可以被 精准设计。

研究方法

本研究采用 两步设计协议：

水溶性荧光激活蛋白 (wFAP) 的设计

• 利用 四螺旋束 (four-helix bundle) 背骨，构建 中心口袋，以 氰基苯乙腈 (HBC599) 作为目标荧光配体；
• 通过 Rotamer Interaction Field (RIF) docking 方法 预组织配体结合口袋；
• Rosetta 用于 序列设计和柔性骨架优化，以提高 蛋白-配体相互作用能量和形状互补性。

跨膜荧光激活蛋白 (tmFAP) 的设计

• 在 wFAP 基础上转化为 tmFAP，重新设计 面向膜环境的表面残基，以最小化对 配体结合口袋结构 的影响；
• 使用 ColabDesign 框架 和 梯度引导的幻觉 (gradient-guided hallucination) 方法生成 跨膜螺旋序列；
• 保留 与配体结合口袋的一致性，并通过 AlphaFold 2 (AF2) 验证 序列-结构匹配度。

深度学习与能量优化的结合

AlphaFold 2 (AF2) 与 Rosetta 的结合

• AF2 用于预测蛋白质骨架结构，并指导 Rosetta 进行柔性骨架设计与优化；
• Rosetta 优化过程中应用 界面能量、形状互补性 和 总能量评分 进行 多轮迭代优化；
• AF2 的高准确性 帮助选择 与设计模型高度匹配 的序列和结构。

ColabDesign 框架中的幻觉设计 (Hallucination Design)

• 利用 ColabDesign 框架 进行 梯度引导的幻觉设计；
• 采用 特定的丢分函数，包括 折叠置信度 (pLDDT) 和 口袋结构保留度，以保证 配体结合口袋的一致性和膜区段的准确编码；
• 多轮迭代更新，直至生成 与设计模型高度匹配的跨膜螺旋序列。

实验验证与结构解析

荧光激活实验

• 体外荧光激活实验：在 E. coli 和 CHO 细胞 中表达后显示出 强烈的荧光激活；
• 配体结合亲和力 (Kd) 测定：通过 荧光滴定实验 计算 HBC599 的 Kd 值。

X-ray 晶体结构 和 冷冻电镜 (cryo-EM) 解析

• 晶体结构 验证 apo 和配体结合态 的 口袋预组织；
• 冷冻电镜 验证 tmFAP 在膜环境中 的 四螺旋束结构和配体结合模式。

整理 | WJM

参考资料

Zhu, J., Liang, M., Sun, K. et al. De novo design of transmembrane fluorescence-activating proteins. Nature (2025).

https://doi.org/10.1038/s41586-025-08598-8