CUT&Tag 数据处理和分析教程（1）

引言

CUT&Tag 简介

在真核细胞的核里，DNA 上发生的所有动态活动，比如基因表达调控，都离不开一个由核小体（包括它们的化学修饰）、转录因子和相关蛋白复合物组成的染色质环境。不同的染色质特征会标记出激活或抑制基因表达的调控区域，以及那些在细胞类型间有差异、在发育过程中会变化的染色质区域。

过去，科学家们通常用染色质免疫沉淀（ChIP）技术来定位这些染色质特征的全基因组分布。ChIP 的做法是先把染色质交联固定并溶解，然后用针对特定蛋白或修饰的抗体把相关的 DNA 片段“捞”出来（见图 1a）。这项技术自35年前问世以来，基本操作方式没太大变化，但问题在于信号和噪声不好区分，还容易出现干扰结果的伪影。后来出现了一种替代方法——体内酶锚定技术，通过抗体或融合蛋白锁定目标染色质蛋白或修饰，再对下面的 DNA 进行标记或切割。这类方法在过去20年里不断发展，其中一种叫 Cleavage Under Targets & Tagmentation（简称 CUT&Tag）的技术用到了 protein-A-Tn5（简称 pA-Tn5）转座酶融合蛋白（见图 1b）。在 CUT&Tag 中，先把细胞或细胞核透化处理，然后加入针对特定染色质蛋白的抗体，再让带着镶嵌末端接头的 pA-Tn5 附着到抗体结合的地方。接着，通过添加镁离子激活转座酶，把接头插入附近的 DNA 上，最后扩增这些接头来构建测序文库。这种基于抗体锚定 Tn5 的方法灵敏度很高，因为样本在 pA-Tn5 附着后会经过严格清洗，而且接头插入效率也很高。相比传统的 ChIP-seq，CUT&Tag 的信噪比大大提高，绘制染色质特征所需的测序量减少了十倍左右。这使得我们可以把多个样本（一般最多90个）混在一起，通过给文库加上条形码并用 PCR 扩增后，在 Illumina NGS 测序仪上进行双端测序。

目标

这个教程是为了指导大家如何处理和分析按照 Bench top CUT&Tag V.3 协议生成的 CUT&Tag 数据。我们用来说明的例子是人类淋巴瘤 K562 细胞系中组蛋白修饰的分布数据，不过这个教程的适用范围很广，可以用来分析任何染色质蛋白，比如转录因子、RNA 聚合酶 II，还有带表位标签的蛋白。

数据处理和分析概述

依赖

• Linux system
• R (versions >= 3.6)
  • dplyr
  • stringr
  • ggplot2
  • viridis
  • GenomicRanges
  • chromVAR
  • DESeq2
  • ggpubr
  • corrplot
  • ChIPseqSpikeInFree [Optional]

library(dplyr)
library(stringr)
library(ggplot2)
library(viridis)
library(GenomicRanges)
library(chromVAR) ## For FRiP analysis and differential analysis
library(DESeq2) ## For differential analysis section
library(ggpubr) ## For customizing figures
library(corrplot) ## For correlation plot

• FastQC(version >= 0.11.9)
• Bowtie2 (version >= 2.3.4.3)
• samtools (version >= 1.10)
• bedtools (version >= 2.29.1)
• Picard (version >= 2.18.29)
• SEACR (version >= 1.3)
• deepTools (version >= 2.0)

数据下载

本教程中使用的数据来自 Kaya-Okur 等人（2020年），可以从 GEO 上下载。

wget -O $projPath/data/IgG_rep2/IgG_rep2_R1_001.fastq.gz ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR875/001/SRR8754611/SRR8754611_1.fastq.gz

wget -O $projPath/data/IgG_rep2/IgG_rep2_R2_001.fastq.gz ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR875/001/SRR8754611/SRR8754611_2.fastq.gz

wget -O $projPath/data/IgG_rep2/IgG_rep2_R1_002.fastq.gz ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR875/002/SRR8754612/SRR8754612_1.fastq.gz

wget -O $projPath/data/IgG_rep2/IgG_rep2_R2_002.fastq.gz ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR875/002/SRR8754612/SRR8754612_2.fastq.gz