CUT&Tag 数据处理和分析教程（3）

数据科学工厂

发布于 2025-03-14 17:20:35

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引言

本系列[1] 将开展全新的CUT&Tag 数据处理和分析专栏。

Bowtie2 比对

CUT&Tag 插入文库的构造，采用 Tn5 适配器和带有条形码的 PCR 引物，具体如下所示：

常规操作是在一个 HiSeq 2500 测序通道中，对最多 90 个混合样本进行单索引 25x25 双端 Illumina 测序，每份样本都带有独特的 PCR 引物条形码。每个文库的样本量会经过调整，确保获得大约 500 万对端读数，这样就能用高特异性、高产量的抗体清晰地分析出丰富的染色质特征。那些不太显著的特征通常需要的读数较少，而如果抗体质量不高，则可能需要更多读数来构建可靠的染色质图谱。

hg38 比对

##== linux command ==##
cores=8
ref="/path/to/bowtie2Index/hg38"

mkdir -p ${projPath}/alignment/sam/bowtie2_summary
mkdir -p ${projPath}/alignment/bam
mkdir -p ${projPath}/alignment/bed
mkdir -p ${projPath}/alignment/bedgraph

## Build the bowtie2 reference genome index if needed:
## bowtie2-build path/to/hg38/fasta/hg38.fa /path/to/bowtie2Index/hg38

bowtie2 --end-to-end --very-sensitive --no-mixed --no-discordant --phred33 -I 10 -X 700 -p ${cores} -x ${ref} -1 ${projPath}/fastq/${histName}_R1.fastq.gz -2 ${projPath}/fastq/${histName}_R2.fastq.gz -S ${projPath}/alignment/sam/${histName}_bowtie2.sam &> ${projPath}/alignment/sam/bowtie2_summary/${histName}_bowtie2.txt

双端读数使用 Bowtie2 工具进行比对，参数设置为 --end-to-end --very-sensitive --no-mixed --no-discordant --phred33 -I 10 -X 700，用来定位长度在 10-700 bp 之间的插入片段。

关键步骤：对于我们标准的 25x25 双端测序，不需要修剪读数，因为插入片段超过 25 bp 的读数不会包含适配器序列。但如果用户进行更长的测序，就需要用 Cutadapt 工具修剪读数，并调整参数为 --local --very-sensitive --no-mixed --no-discordant --phred33 -I 10 -X 700 进行比对，以忽略读数 3’ 端可能残留的适配器序列。

比对总结

Bowtie2 的比对结果概要会存储在 {projPath}/alignment/sam/bowtie2_summary/{histName}_bowtie2.txt 文件中，您可以看到类似的结果。

2984630 reads; of these:
  2984630 (100.00%) were paired; of these:
    125110 (4.19%) aligned concordantly 0 times
    2360430 (79.09%) aligned concordantly exactly 1 time
    499090 (16.72%) aligned concordantly >1 times
95.81% overall alignment rate