转录组 课前背景

本篇内容引自生信技能树

一、课前背景

1、转录组数据分析一般流程

转录组数据分析一般流程

2、转录组概述

（1）分析准备

课题实验设计、测序方案选择，不同数据质控点

（2）核心分析

表达定量、差异表达分析、功能层面解释

（3）高级分析内容（自学）

可视化、其它RNA组学、其它组学联合分析

3、转录组的几种分析策略

（a）有参考的DNA基因组序列

（b）有参考的转录组层面的RNA序列

（c）没有基因标准参考的序列

4、应用案例

（1）airway data（课上使用数据）

（2）肺癌耐药关键gene筛选（课上实战案例）

（3）非模式物种辣椒（课上实战案例）

（4）非模式物种人参(课上实战案例)

5、转录组测序原理——中心法则

中心法则

基因组学、转录组、蛋白组、代谢组、表观组（DNA上的遗传表观：甲基化、乙酰化；RNA上的表观调控）、互作组（蛋白质之间，RNA之间，DNA序列和转录因子之间）

6、转录组概念

（1）转录组的概念

一群细胞或所有细胞里面的所有RNA转录本，有很多类型，分为编码和非编码。

（2）编码RNA-mRNA

mRNA具有经典的5’帽子和3’polyA尾巴（根据它提取）。

（3）长链非编码RNA-lncRNA

是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA；

少部分lncRNA具有 3’polyA尾巴。

（4）环状RNA-circRNA

封闭环状结构。

（5）微小RNA-microRNA

一类内生的、长度约20-24nt的小RNA。

（6）其他非编码小 RNA/sncRNA之----- piRNA

（7）其他sncRNA之----- tsRNA—低丰度

（8）不同RNA在细胞中的绝对数量

（9）不同基因类型之：gene_biotype

PPT里链接请留意

7、参考基因组注释文件-gff/gtf文件介绍

注释gff文件格式

第三列type

第九列详解

GFF和GTF

习题

R语言里演示了一遍，自己用bash编程语言写答案

type和biotype一定要分清

我的答案如下（感觉我写的蛮复杂，肯定有更简单的答案）：

less -NS Data/Homo_sapiens.GRCh38.102.chromosome.Y.gff3.gz | grep -v '^#' | cut -f 9 | grep -w -n '^ID=gene' > file1

less -NS file1 | awk -F ';' '{print $1,$2,$3}' | sed -e s/ID=gene://g -e s/biotype=/'\t'/g -e s/Name/'\t'/g > file2

8、转录组测序实验流程图

流程图

（1）RNA样品检测

纯度和完整性检验

（2）文库构建

cDNA文库构建，画红框的部分

（3）边合成边测序

SBS

上机测序完成之后得到的测序数据：FASTQ文件

二、准备工作——工作目录

# 默认展开所有层，使用-L参数控制展开的目录层级
tree ./ -L 1 

# 查看整个分析目录准备结构
tree ./

三、FASTQ数据格式介绍

1、fq数据下载，markdown笔记有

2、fastq数据格式

有多少序列，M是10的6次方，百万；

有多少碱基，G是10的9次方，十亿，转录组一般测6个G；

Q20至少要在85%以上，Q30要在90%以上。

3、课后练习

1、 zless -NS SRR1039510_1.fastq.gz | grep -c -E '^@SRR'

2、zless -NS SRR1039510_1.fastq.gz | grep -n '^@SRR' | less -NS

2、zless -NS SRR1039510_1.fastq.gz | sed -n '1~4 p' |less -NS

3、zless -NS SRR1039510_1.fastq.gz | sed -n '2~4 p' |less -NS

4、zless -NS SRR1039510_1.fastq.gz | sed -n '2~4 p' | wc

5、

老师的答案在markdown里面

查看有没有reads重复出现的指令：

zless -S SRR1039510_1.fastq.gz |awk '{ if(NR%4==2) {print} }' | sort | uniq -c | sort -k 1 -n -r | less -NS

4、为什么序列会重复

基因表达量高，转录本数量多，所以转录组数据里面一定是有重复的。

文库里面，有效捕获的序列太少了，当测的数据比较多的时候，重复值会很高；

PCR重复，有samtools这个工具来解决；

统计fq里面序列出现的频率非常有用，将会是排查异常样本的依据。