三代测序100问（6）：ONT数据分析如何挑选最佳质控工具？

在上一期《三代测序100问》中，我们详细探讨了PacBio测序数据的质控策略与工具选择。今天，我们将目光转向另一长读长技术巨头——牛津纳米孔（ONT）测序平台，以及近期崭露头角的国产纳米孔测序仪。山东第一医科大学李冕博士指出，对于ONT及其同行而言，单链碱基质量的挑战曾是业界长期的“痛点”，因此，在数据分析前对这些数据进行严格的质量控制，显得尤为重要。

“无论数据来源于ONT自身，还是国产纳米孔平台，或是从公共数据库下载，拿到下机数据后的第一步，都必须是审慎地查看其质量状况。”李博士强调。虽然去年随着ONT最新试剂和Dorado等新版Basecaller模型的发布，单链读取的碱基质量中位数已实现了Q20+的突破（即准确度达到99%），但这并不意味着我们可以放松警惕。目前国产纳米孔平台单链读取的碱基质量整体仍维持在Q15-Q16左右（准确度约97%），这使得数据分析前的质量查看和过滤，成为确保后续结果可靠性的关键一环。

纳米孔数据质控的“利器”盘点

面对纳米孔测序数据的特性，市场上涌现出多款优秀的质控工具，它们各有所长，能够帮助研究者们全面评估数据质量，并进行必要的预处理：

1. NANOPACK套件：纳米孔数据质控的经典之选

由比利时佛兰德斯生物技术研究所的Wouter De Coster团队开发的NANOPACK套件，是纳米孔数据质控领域最经典的质控工具。它能够满足不同层次的质控需求：

• NanoPlot： 专为单个样本设计，能够生成详尽的测序质量报告和可视化图表，让你对数据概况一目了然。
• NanoComp： 如果你有多个纳米孔样本需要比较，NanoComp则能同时对它们进行质量评估，方便你进行横向对比，快速发现批次效应或异常样本。
• Chopper： 作为套件中的预处理工具，Chopper可以对测序数据进行修剪和过滤，去除低质量的碱基或短读长，为后续分析“精兵简政”。

1. fastplong：长读长通用质控新星

在上一期我们推荐过、由开发二代数据质控神器fastp的OpenGene团队推出的fastplong工具，同样适用于纳米孔测序数据。“对于追求高效便捷的老师和同学们，fastplong绝对是值得信赖的‘一站式解决方案’。”李博士表示。它不仅能提供全面的质量统计，还能通过简洁的命令行操作，轻松完成数据过滤和修剪，并且支持conda一键安装，极大地简化了使用门槛。

1. Bamboo：华大纳米孔数据的“定制工具”与更多可能

去年9月，华大集团发布了其自家的纳米孔测序仪CycloneSEQ-WT02和WY01，紧接着在10月推出了一款名为Bamboo的长读长数据质控工具。李博士在测试后对其赞不绝口：“Bamboo在统计指标和图表的丰富程度上表现非常优秀，同样集质量查看、修剪和过滤功能于一身。”

值得注意的是，Bamboo还能在有参考基因组的情况下，提供测序覆盖度的详细指标，这对于评估测序深度和均匀性至关重要。 “如果你的数据来自华大自家的纳米孔测序仪，那么Bamboo无疑是首选工具，毕竟‘自家’软件对自家数据有更深的优化。”李博士补充道，“当然，对于来自其他纳米孔测序仪的数据，如ONT、谱译、齐碳等，你也可以尝试使用Bamboo，因为质控软件的算法通常具有一定的通用性。”

质控：数据分析的“生命线”

李博士再次强调了数据质量控制的根本重要性：“数据分析领域有一句格言：‘Garbage in, Garbage out’。这意味着，无论后续的分析多么精妙复杂，如果输入的数据质量不过关，最终的产出也将大打折扣。”

因此，在着手进行基因组组装、结构变异检测、全长转录组分析等任何下游研究之前，务必确保你的纳米孔测序数据经过严格的质量评估和必要的预处理。 这是保障你的科研成果准确性、可靠性的“生命线”。

希望今天的分享，能帮助你在纳米孔测序数据的质控环节，做出最明智的工具选择，为你的后续分析打下坚实的基础！