UMI-RNAseq—转录组绝对定量

生信菜鸟团

发布于 2025-06-19 09:09:13

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UMI-RNAseq

UMI(Unique molecularidentifier)——特异性分子标签（UMI）为 8-10nt 的短序列，可看做“条形码”，在文库构建时通过连接接头引入UMI标签连接到cDNA分子中，标记原始样品中的每个分子，对同一来源扩增产物进行追踪和最终提取分组，用于排除 PCR 扩增偏好性和测序偏好性引入的定量偏差，便于获得足够的读数以进行分析。

UMI-RNAseq技术是利用高通量测序技术在文库构建时引入特异性分子标签UMI，通过计数 UMI 的个数，我们便可以对原始的 RNA 分子进行“绝对定量”。

UMI绝对定量示意图

传统 RNA-seq 定量分析是存在一定缺陷的，不可避免的会有duplication的产生。Dup的产生固然有天然重复序列的原因，但更主要的是PCR扩增偏好性和不均匀性所致。从而导致定量与真实值存在偏差，为了纠正二代测序过程中带来的系统偏差，从而发展出了UMI-RNAseq。

UMI-seq 优势与应用

定量精准：添加UMI标签，可有效降低Duplication产生的影响，提高定量准确性
RNA起始量低：UMI-small RNAseq低至200ng起始量；UMI-mRNAseq低至50ng起始量。
低拷贝基因的鉴定：避免由于PCR扩增本身对低拷贝片段扩增不准确而造成对定量结果的影响。
序列质量高：矫正扩增错误的碱基/SNP/Indel；准确识别重复类型/可变剪切；RNA编辑分析更准确

原理及优势

UMI-RNAseq 建库流程

建库流程

利用真核生物大部分mRNA都带有polyA尾的结构特征，通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA;
加入片段化试剂（Fragmentation Buffer)将mRNA 随机打断成短片段；
以短片段为模板逆转录合成cDNA,之后进行cDNA末端修复、加A尾、并连接UMI标签和测序接头；【关键点：UMI 在这一步被引入，每个cDNA分子理论上会连接上一个带有独特UMI序列的接头。】
最后进行PCR扩增并获得文库；【最终的测序文库分子结构（从5'到3'端看其中一条链）大致为：P5 - Rd1 SP - UMI - cDNA insert - Rd2 SP - index - P7。】
文库质检合格后采用illumina平台进行测序，测长通常为PE150。

UMI-RNAseq 分析流程

分析流程

定量流程

首先是确定测序数据的文库信息，比如示例用到的文库是：

文库信息示例

Read 2 的前 8 个碱基是 UMI，随后是 3 个碱基的连接子和 3 个碱基的非模板添加序列，之后才是真正的转录本序列。

原始数据QC检查

数据预处理

提取8nt的UMI序列( umi_tools )

vim st1_r2_8nt_extract.sh

#! /bin/bash -xe
#
biosoft=/home/username/miniconda3/envs/scRNA/bin/umi_tools
project=/home/username/project/umi_rnaseq/r2_umi_8bp
outdir=${project}/st1_extract
Log=${project}/st0_log
fq1=$1
fq2=$2
id=$3

if [ ! -d ${outdir} ];
then mkdir -p ${outdir}
fi

/usr/bin/time -v ${biosoft} extract --extract-method=string \
--bc-pattern=NNNNNNNN \
--stdin ${fq2} \
--read2-in ${fq1} \
--stdout ${outdir}/${id}_extract_2.fastq.gz \
--read2-out ${outdir}/${id}_extract_1.fastq.gz 1>${Log}/st1_${id}_extract.log  2>&1

QC检查

质控(trim_galore)

使用trim_galore 去除R2的连接子和添加序列

vim st2_trim_cut6nt.sh

#! /bin/bash -xe
#
biosoft=/home/username/miniconda3/envs/RNAseq/bin/trim_galore
project=/home/username/project/umi_rnaseq/r2_umi_8bp
outdir=${project}/st2_clean_cut6nt_data
Log=${project}/st0_log
fq1=$1
fq2=$2
id=$3

if [ ! -d ${outdir} ];
then mkdir -p ${outdir}
fi

/usr/bin/time -v  ${biosoft} -q 28 --phred33 --length 30 --max_n 3 \
        --stringency 3 --paired  --clip_R2 6 --gzip --cores 4 \
        -o ${outdir} \
        ${project}/st1_extract/${id}*.gz 1>${Log}/st2_${id}_trim.log 2>&1


##参数释义
--clip_R2 <int> #用于 双端测序（paired-end）的专用参数，作用是从 read2 的 5' 端（起始端） 剪切掉指定数量（<int>）的碱基。这是专门针对双端测序中 reads2 的建库引入序列的操作

QC检查

比对(hisat2)

vim st3_hisat2_cut6nt.sh

#! /bin/bash -xe
#

biosoft=/home/username/miniconda3/envs/RNAseq/bin/hisat2
index=/home/username/reference/human/GRCh38/hisat2_indx/GRCh38_genome
project=/home/username/project/umi_rnaseq/r2_umi_8bp
fqdir==${project}/st2_clean_cut6nt_data
outdir=${project}/st3_hisat_cut6nt_outs
Log=${project}/st0_log
fq1=$1
fq2=$2
id=$3


if [ ! -d ${outdir} ];
then mkdir -p ${outdir}
fi

/usr/bin/time -v  ${biosoft}  -p 4  \
-x  ${index} \
-1 ${fq1} \
-2 ${fq2}  2>${Log}/st3_${id}_cut6nt_hisat2.log | samtools sort -@ 2 -o ${outdir}/${id}.sort.bam 1>${Log}/st3_${id}_cut6nt_samsort.log 2>&1

提交任务：

##提交
ls ${PWD}/{1..9}*1.fq.gz |paste - <(ls ${PWD}/{1..9}*2.fq.gz) <(ls {1..9}*1.fq.gz|cut -d "_" -f 1,2) > ../st3_hisat2_cut6nt_config.txt

screen -r r2
cat st3_hisat2_cut6nt_config.txt |xargs -iF -P 10 sh -c 'bash st3_hisat2_cut6nt.sh F'

比对结果

$grep "overall alignment" st3*cut6nt_hisat2.log
st3_10_S31_cut6nt_hisat2.log:90.66% overall alignment rate
st3_1_S22_cut6nt_hisat2.log:90.51% overall alignment rate
st3_2_S23_cut6nt_hisat2.log:91.23% overall alignment rate
st3_3_S24_cut6nt_hisat2.log:86.22% overall alignment rate
st3_4_S25_cut6nt_hisat2.log:89.86% overall alignment rate
st3_5_S26_cut6nt_hisat2.log:91.30% overall alignment rate
st3_6_S27_cut6nt_hisat2.log:92.39% overall alignment rate
st3_7_S28_cut6nt_hisat2.log:91.02% overall alignment rate
st3_8_S29_cut6nt_hisat2.log:93.67% overall alignment rate
st3_9_S30_cut6nt_hisat2.log:92.92% overall alignment rate

##结果bam文件大小
$ls -lha *.bam |cut -d " " -f 5-
3.0G 4月  29 16:30 10_S31.sort.bam
3.4G 4月  29 16:31 1_S22.sort.bam
4.5G 4月  29 16:45 2_S23.sort.bam
4.7G 4月  29 16:49 3_S24.sort.bam
4.0G 4月  29 16:41 4_S25.sort.bam
6.0G 4月  29 17:03 5_S26.sort.bam
4.5G 4月  29 16:42 6_S27.sort.bam
3.9G 4月  29 16:37 7_S28.sort.bam
3.4G 4月  29 16:32 8_S29.sort.bam
2.1G 4月  29 16:21 9_S30.sort.bam

umi 去重(umi_tools)

相比于Bulk转录组区别的关键步骤

vim st4_umi_cut6nt_dup.sh

#! /bin/bash -xe
#

biosoft=/home/username/miniconda3/envs/scRNA/bin/umi_tools
project=/home/username/project/umi_rnaseq/r2_umi_8bp
bamdir=${project}/st3_hisat_cut6nt_outs
outdir=${project}/st4_umi_cut6nt_dup
Log=${project}/st0_log
fq1=$1
fq2=$2
id=$3

if [ ! -d ${outdir} ];
then mkdir -p ${outdir}
fi

cd ${bamdir} && samtools index ${id}.sort.bam

/usr/bin/time -v  ${biosoft} dedup \
-I ${bamdir}/${id}.sort.bam \
--paired --output-stats=deduplicated \
-S ${outdir}/${id}_sort_dup.bam 1>${Log}/st4_${id}_cut6nt_umidup.log 2>&1

##批量提交任务
screen -r r2
cat st3_hisat2_cut6nt_config.txt |xargs -iF -P 10 sh -c 'bash st4_umi_cut6nt_dup.sh F'

去重后文件大小

$ls -lha *.bam |cut -d " " -f 5-
2.2G 4月  30 18:21 10_S31_sort_dup.bam
2.5G 4月  30 18:22 1_S22_sort_dup.bam
3.3G 4月  30 20:04 2_S23_sort_dup.bam
3.1G 4月  30 20:28 3_S24_sort_dup.bam
2.9G 4月  30 19:29 4_S25_sort_dup.bam
4.3G 4月  30 20:59 5_S26_sort_dup.bam
3.3G 4月  30 19:28 6_S27_sort_dup.bam
2.9G 4月  30 18:56 7_S28_sort_dup.bam
2.6G 4月  30 18:16 8_S29_sort_dup.bam
1.7G 4月  30 17:43 9_S30_sort_dup.bam

单从文件大小来看，也可以确定处理前后发生了明显变化。

定量(featureCounts)


mkdir st5_r2_umi_count && cd st5_r2_umi_count

gtf='/home/username/reference/human/GRCh38/gencode.v44.annotation.gtf'
ls -lha $gtf

featureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id -a $gtf -o r2_8bp_umi_id.txt ../st4_umi_cut6nt_dup/*.bam

至此上游定量流程就完成了。

参考链接

- https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIyMTI1NDU0Ng==&mid=2247485063&idx=1&sn=263295d238f86b27ecb2238e6e27f6ae&chksm=e83ec07adf49496cedc88272bca446decb092b04088b5c336858739e3768d9a4d83bf9f8e530&token=1373935942&lang=zh_CN#rd)
- https://mp.weixin.qq.com/s/NyUMI-2SWl3NwCgsS4yfBA
- https://www.genechem.com.cn/proinfo/138.html
- https://www.bilibili.com/video/BV1924y1F7cr/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=123365f2db254d22dab5943e8c83caf0
- https://www.bilibili.com/video/BV1fjHXetESF/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=123365f2db254d22dab5943e8c83caf0
- https://www.bilibili.com/video/BV1jK4y1u7P5/?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=123365f2db254d22dab5943e8c83caf0
- https://www.yunbios.net/UMI-RNA-seq.html#

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