转录组——下游分析

一、差异表达分析

1、数据标准化

上游定量得到的原始count表达矩阵：raw count。

（1）数据标准化-why？

为什么要进行标准化？

计数结果的差异的影响因素：落在参考区域上下限的read是否需要被统计，按照什么样的标准进行统计。

标准化的主要目的是去除测序数据的测序深度和基因长度。

• 测序深度：同一条件下，测序深度越深，基因表达的read读数越多。

• 基因长度：同一条件下，不同的基因长度产生不对等的read读数，基因越长，该基因的read读数越高。

（2）各种值的使用场合

①差异表达分析：原始count值，算法输入要求（针对二代测序差异分析算法，

算法内部一般有标化方法）。

②标化后的值：基因表达值在样本与样本之间具有可比性。PCA分析，样本表达总体分布，生存分析，热图绘制，相关性分析（FPKM、RPM、TPM值）。

③帖子：count转TPM/FPKM实战（GSE229904）

（3）数据预处理

在分析之前，一般会对基因表达进行过滤，比如：低表达的基因

以下是常见的几种过滤方式

• 在至少在75%的样本中都表达的基因

• 过滤平均值count<10的基因

• 过滤平均cpm <10 的基因

2、异常样本和重复性检测

在实验前期，我们已经设置好相关分组信息。

那么有没有什么办法来看看是否存在异常样本？

是否组内样本的重复性合格？

是否前期设置的组与组间可以分开？

（1）样本表达总体分布

①箱式图

②小提琴图

③密度曲线图

raincloud云雨图：一图囊括小提琴+箱线图+散点图

（2）样本之间的相关性

PCA主成分分析：每组三个样本的PCA分析到底能不能加圈？（推文）

相关性分析

层次聚类树

3、差异表达分析

差异分析-edgeR

差异结果可视化：热图和火山图，公众号有画图专辑

二、差异基因功能注释

功能注释：查询感兴趣的基因/基因集合参与哪些可能的生命过程，起到了什么作用？

1、利用GO/KEGG注释给这些基因赋以“功能标签”

1. 差异分析筛选基因：MAOA(按照FC排序取top10)（NCBI-GeneID ：4128）
2. 进入KEGG搜索界面：https://www.genome.jp/kegg/mapper/color.html
3. 选择Organism-specific为：hsa
4. 选择Optional use of outside类型为：NCBI-GeneID
5. 输入MAOA基因（如格式：4128 red，是gene id 以及把该基因标上什么颜色） Q8：KEGG数据库物种对应关系表查询：https://www.kegg.jp/brite/br08601 代码版本查询：如何批量查询单个基因的功能通路？（推文）：https://mp.weixin.qq.com/s/vnhX_C0G7L6AoRK-Jkkv2Q kegg pathway 通路高亮标记基因（推文）：https://mp.weixin.qq.com/s/GZ4mILvzM6LuaaNa7feAOg

2、 查看多个疾病风险基因注释到哪些通路（适用于复杂疾病）

1. 从通过差异表达分析获得airway数据集trt和untrt间差异表达基因集合：共640个基因
2. 进入KEGG搜索界面https://www.genome.jp/kegg/mapper/color.html
3. 选择Organism-specific为：hsa
4. 选择Optional use of outside类型为：NCBI-GeneID
5. 输入差异表达基因列表：DEG_limma_voom_all-2.txt
6. 点击Exec

三、基因功能富集

这些基因对哪些功能的影响有针对性，不是随机影响的?——功能的富集分析

1、功能富集分析的原因

• 一组基因直接注释的结果是得到大量的功能结点。这些功能具有概念上的交叠现象，不利于进一步的精细分析，所以研究人员希望对得到的功能结点加以过滤和筛选，以便获得更有意义的功能信息。
• 富集分析方法通常是分析一组基因在某个功能结点上是否过出现(over- presentation)。由单个基因的注释分析发展到大基因集合的成组分析。和随机比较，关注的基因集显著注释的功能节点。

2、功能富集分析的统计方法-over-presentation

（1）超几何分布及累积超几何分布

（2）二项分布及累积二项分布

（3）卡方检验或Fisher精确检验

结果美化的专辑 #绘图小技巧2025

3、功能富集分析-结果可视化

4、功能富集GSEA

（1）GSEA预定义基因集合MSigDB

Broad研究所在提出GSEA方法的同时还提供了一个基因集数据库——MSigdb。它从位置，功能，代谢途径，靶标结合等多种角度出发，构建出了许多的基因集合，并将其保存在MSigDB。

https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp

（2） 结果解读

https://www.gsea-msigdb.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html

5、GSVA分析

基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA），一种以非监督方式对一个简

单群体评估通路活性变异的GSE方法。

https://mp.weixin.qq.com/s/1T7GS00uJzHwCAcmvDm6qg