【辰辉创聚生物】单B细胞筛选技术：制备兔单抗

单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）在基础研究、临床诊断和治疗领域均具有重要地位。与小鼠、人源等其他物种抗体相比，兔源单抗因其高亲和力、广泛的抗原识别谱及独特的免疫应答模式而逐渐受到重视。尤其是在识别小分子、糖类或构象依赖性抗原时，兔抗体展现出明显优势。

然而，传统制备兔单抗的方式存在诸多限制。杂交瘤技术在兔体内效率低且细胞株不稳定，难以规模化应用；噬菌体展示和其他体外筛选方法虽灵活，但常出现重轻链错配，影响抗体功能。为克服这些问题，近年来发展起来的单B细胞筛选（single B cell screening）技术，已成为制备兔单抗的重要手段。该技术能够直接分离免疫兔体内的抗原特异性 B 细胞，获取其天然配对的 VH 和 VL 序列，并在体外快速重组表达抗体。

单B细胞筛选技术原理

单B细胞筛选技术的核心思想是在单细胞水平获取并利用免疫动物产生的天然抗体库。在抗原免疫后，兔体内部分 B 细胞分化为浆细胞或记忆 B 细胞，这些细胞表达的免疫球蛋白通常具有高亲和力和高特异性。通过分离抗原特异性 B 细胞，并进行单细胞 RT-PCR，可获得其 VH 和 VL 序列。将其克隆入载体并在哺乳动物或无细胞系统中表达，即可生成完整抗体或 Fab/Zipbody 片段。

与杂交瘤相比，该方法避免了细胞融合效率低下及不稳定性问题；与噬菌体展示相比，它能够保持重链和轻链的天然配对，更真实地反映免疫系统的应答。因此，单B细胞筛选技术在速度、效率和准确性上均具有优势。

单B细胞抗体筛选技术实验流程

单B细胞筛选技术

1. 动物免疫

常用新西兰大白兔等品系作为实验动物。根据研究目标，可选择全长蛋白、特定结构域、多肽或糖缀合物作为免疫原，通常配合弗氏佐剂等增强免疫反应。经过数周免疫后，兔体内即可产生足够数量的抗原特异性 B 细胞。

2. B 细胞分离

采集免疫后兔的外周血单个核细胞（PBMC），或取脾脏、淋巴结细胞。利用密度梯度离心分离细胞群体，再通过免疫磁珠富集 B 细胞。

3. 抗原特异性筛选

将目标抗原进行荧光标记，通过流式细胞术检测并筛选结合抗原的 IgG B 细胞。常采用“双荧光标记”策略，即同一抗原用两种不同荧光染料标记，以降低假阳性风险。通过门控排除死细胞和非B细胞，最终获得纯度较高的目标细胞群。

4. 单细胞分选

利用荧光激活细胞分选仪（FACS）将抗原特异性 B 细胞分配到 96 孔或 384 孔板，每孔仅含一个细胞，确保后续分子克隆能追溯至单个克隆来源。

5. VH/VL 序列获取

在单细胞水平进行 RT-PCR 扩增，获得重链和轻链的可变区序列。由于兔免疫球蛋白基因库复杂，研究者通常使用覆盖性引物库或 5′-RACE 方法来增加扩增成功率。

6. 表达与筛选

将扩增得到的 VH/VL 序列与兔 IgG 恒定区拼接，构建哺乳动物细胞表达载体，或利用无细胞系统快速表达 Fab/Zipbody 抗体片段。随后通过 **ELISA、流式检测或 SPR（表面等离子共振）** 测定抗体的亲和力和特异性。

7. 功能验证与优化

候选抗体经过初步筛选后，还需进行功能学实验，例如中和实验、信号通路阻断实验或活性检测。若应用于治疗，还需进一步进行人源化改造与亲和力成熟。

单B细胞筛选关键技术点

1. 抗原标记策略：保持抗原天然构象至关重要，双标记能有效减少假阳性。

2. B 细胞亚群选择：记忆 B 细胞和浆母细胞常包含高亲和力克隆。

3. PCR 引物设计：兔抗体基因多样性高，需要覆盖全面的引物库。

4. 表达系统选择：早期筛选可用无细胞系统（如 Ecobody 技术），最终验证依赖哺乳动物细胞表达。

5. 检测方法：ELISA 筛选结合活性，SPR 或 BLI 测定亲和力，功能实验确认生物学效果。

单B细胞筛选技术优势

快速：从免疫到获得候选抗体仅需 1–2 周。

天然配对：保留 VH/VL 天然组合，避免体外错配。

高亲和力：兔抗体在识别小分子、糖类和构象抗原方面优势明显。

捕获稀有克隆：能够发现低频但高效的抗体克隆。

可扩展性强：可与高通量测序、微流控技术结合，形成规模化筛选平台。

应用实例

1. 兔单抗制备

研究团队利用双荧光标记结合流式分选，从免疫兔 PBMC 中成功分离抗原特异性 IgG B 细胞。通过高效转录-翻译系统，仅一周即获得多株功能性兔单抗，部分抗体展现纳摩尔甚至亚纳摩尔级亲和力，验证了该方法的高效性。

2. 诊断试剂开发

单B细胞技术在诊断学中也展现优势。研究团队利用该方法成功获得了能够识别小分子药物代谢物和特定糖抗原的兔单抗，并用于开发高灵敏度 ELISA 试剂盒。这类试剂在临床诊断和食品安全检测中具有应用价值。

3. 抗肿瘤抗体的探索

部分研究通过单B细胞筛选，获得了针对 PD-L1、VEGF 等肿瘤相关抗原的兔单抗。这些抗体表现出优于小鼠单抗的结合性能，并在阻断信号通路实验中展现出良好效果，显示了其在治疗性抗体研发中的潜力。

单B细胞筛选技术为制备兔源单克隆抗体提供了一种快速、高效且精确的方法。该技术不仅克服了传统杂交瘤与展示库方法的不足，还能在保持天然 VH/VL 配对的同时，大幅提升抗体筛选效率。大量文献报道表明，利用该方法可获得高亲和力、特异性强且功能突出的兔单抗，应用范围涵盖基础研究、诊断开发与药物研发。随着技术平台的不断完善，单B细胞筛选无疑将继续推动兔单抗在科研和产业化中的广泛应用。