单细胞测序解锁牙周炎中性粒细胞调控网络

牙周炎作为全球高发的口腔慢性炎症，不仅导致牙龈退缩、牙槽骨吸收，还与心血管疾病、糖尿病等全身疾病密切相关。长期以来，中性粒细胞过度激活被认为是牙周病变的核心，但具体调控机制始终是未解之谜。

近日，发表于《Journal of Advanced Research》（IF=14.4）的一项研究，通过单细胞 RNA 测序技术构建人类牙龈组织全景图谱，首次鉴定出NETs 相关中性粒细胞亚群（NrNeu），揭示其在牙周免疫病理中的关键作用，为牙周炎的早期诊断和靶向治疗提供了全新方向！

📚 文献来源：Single-cell atlas of human gingiva unveils a NETs-related neutrophil subpopulation regulating periodontal immunity. Journal of Advanced Research, 2025, IF=14.4.

◆ 1. 人类牙龈单细胞全景图：9 大细胞群精准定位

研究团队对 3 名健康个体和 3 名牙周炎患者的牙龈组织进行单细胞测序，成功捕获 54801 个单细胞，鉴定出成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、T/NK 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等 9 大细胞群体。

关键对比发现：牙周炎组中，中性粒细胞、B 细胞、浆细胞显著富集（中性粒细胞增幅最明显），而基质细胞、上皮细胞和肥大细胞数量减少，直接证实中性粒细胞在牙周炎症中的核心地位。

◆ 2. 中性粒细胞 “四大家族”：NrNeu 亚群浮出水面

通过异质性分析，研究人员将中性粒细胞细分为 4 个功能亚群：

• • N0（NrNeu）：NETs 相关亚群，高表达 FCGR3B、SLC2A3 等基因，仅在牙周炎中显著增加
• • N1（PNeu）：吞噬性亚群，参与病原体清除
• • N2（ANeu）：自噬亚群，富集自噬通路相关基因
• • N3（NNeu）：正常亚群，主要存在于健康牙龈组织

其中，NrNeu 亚群是牙周炎特异性致病亚群，其高表达基因显著富集于中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成通路，通过免疫荧光与 NETs 标志物（MPO、CitH3）共定位，证实其 NETs 生成能力。

◆ 3. 精准预测模型：3 个基因锁定牙周炎风险

基于 NETs 相关基因（NrGs），研究团队利用 6 种机器学习算法，筛选出PTGS2、MME、SLC2A3三个关键基因，构建牙周炎预测模型。

模型验证显示：内部和外部数据集 AUC 值均高于 0.65，稳定性和泛化能力优异，为牙周炎的早期无创诊断提供了可行工具，有望改变当前依赖影像学和临床检查的诊断模式。

◆ 4. 细胞通讯：成纤维细胞 - MIF-CD74/CXCR4 轴

细胞间通讯分析揭示：牙龈成纤维细胞与 NrNeu 的相互作用最为密切，其通过MIF-CD74/CXCR4 信号轴促进 NETs 生成（图 5）：

• • 牙周炎中成纤维细胞分泌 MIF 分子增加
• • NrNeu 表面 CD74/CXCR4 受体高表达
• • 二者结合后激活下游通路，加剧 NETs 介导的炎症损伤

这一发现首次阐明了基质细胞与免疫细胞的跨界调控机制，为开发靶向细胞间通讯的治疗药物提供了靶点。

🖥️ 生信技术解析：从数据到结论的关键方法支撑

作者通过多维度生信方法实现数据挖掘与验证，具体方法如下：

◆ 1. 单细胞测序及细胞分群

• • 测序平台：采用 10x Genomics Chromium 平台进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），获取原始测序数据
• • 细胞类型注释：结合 marker 基因表达特征（如上皮细胞：KRT14、KRT5；成纤维细胞：COL1A1、DCN；中性粒细胞：S100A8、S100A9），并参考已知单细胞数据库（如 Human Cell Atlas），最终将 15 个聚类簇归为 9 大细胞群
• • 中性粒细胞亚群细分：针对中性粒细胞聚类簇，进一步通过更精细的聚类分析（分辨率提升至 1.2），结合差异基因功能注释，划分出 4 个功能亚群。

◆ 2. 差异分析与功能富集

• • 差异基因筛选：使用 Seurat 包的 FindMarkers 函数，以 adjusted P <0.05、|log2FC|> 0.5 为标准，筛选健康组与牙周炎组、不同中性粒细胞亚群间的差异表达基因（DEGs）
• • 功能富集分析：通过 clusterProfiler 包，对 DEGs 进行 Gene Ontology（GO）功能注释（包括生物过程 BP、细胞组分 CC、分子功能 MF）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析，重点验证 NETs 相关通路（如 “neutrophil degranulation”“NET formation”）的富集显著性。

◆ 3. 细胞通讯分析

• • 分析工具：采用 CellChat 包构建细胞间通讯网络，基于配体 - 受体对（ligand - receptor pairs）的表达水平计算通讯强度
• • 核心信号轴挖掘：针对中性粒细胞（尤其是 NrNeu 亚群）与其他细胞群的通讯关系，筛选出通讯强度 top 5 的信号通路，最终锁定 MIF - CD74/CXCR4 轴为关键调控通路，并通过气泡图、和弦图可视化展示。

◆ 4. 预测模型构建与验证

模型构建背景与关键基因筛选

1. 1. 构建依据：基于 NETs（中性粒细胞胞外陷阱）促进牙周炎病理进程的特性，以 NETs 相关基因（NrGs）为基础，构建牙周炎预测模型。
2. 2. 基因筛选流程：

• • 第一步：分别计算 NrGs 中牙周炎上调 / 下调基因，与数据集 GSE16134 中牙周炎相关基因的交集，得到 14 个候选基因。
• • 第二步：对 14 个候选基因进行 Lasso 回归与多因素逻辑回归分析，最终筛选出 3 个关键基因 ——PTGS2、MME、SLC2A3（均在牙周炎患者的 NrNeu 亚群及 GSE16134 中呈上调表达）。

为保障模型验证的可靠性，研究采用 “内部验证 + 外部验证” 双数据集设计，具体如下：

1. 1. 内部验证数据集（IV）：

• • 来源：研究团队自身的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据中的中性粒细胞群体（共 4019 个细胞）。
• • 分组：通过随机抽样分为两部分：
• • 内部训练集（IV-T）：2814 个细胞（占比 70%），用于模型训练；
• • 内部验证集（IV-V）：1205 个细胞（占比 30%），用于初步验证模型性能。

1. 1. 外部验证数据集（EV）：

• • 来源：基因表达综合数据库（GEO）中的牙周炎数据集（编号 GSE16134，测序平台 GPL570）。
• • 样本构成：共包含 310 个样本，其中健康样本 69 个、牙周炎样本 241 个。
• • 分组：通过随机抽样分为两部分：
• • 外部训练集（EV-T）：217 个样本（48 个健康样本 + 169 个牙周炎样本，占比 70%）；
• • 外部验证集（EV-V）：93 个样本（21 个健康样本 + 72 个牙周炎样本，占比 30%），用于验证模型泛化能力。

预测模型构建与验证

模型构建方式：

• • 采用6 种机器学习算法（含逻辑回归、支持向量机 SVM、随机森林等），以 3 个关键基因为核心构建模型。
• • 建模过程中通过5 折交叉验证提升模型稳定性，且交叉验证结果显示模型有效避免过拟合与欠拟合。

模型性能验证：

• • 内部验证（IV）：
• • 训练集（IV-T）：6 种模型的 AUC 中位数为 0.65-0.75；
• • 验证集（IV-V）：AUC 中位数多大于 0.70，基础预测能力达标。
• • 外部验证（EV，使用独立数据集 GSE16134）：
• • 训练集（EV-T）：所有模型 AUC 中位数均大于 0.85；
• • 验证集（EV-V）：结果与 EV-T 高度一致，证明模型泛化能力优异。