宏病毒组分析 (三)：病毒的物种分类与功能基因深度注释

当我们拿到手中的vOTUs序列时，生物学解释工作才刚刚开始。与细菌不同，病毒缺乏像16S rRNA那样通用的分类标记基因，且变异速度极快，这使得传统的基于序列相似性的分类方法（如BLAST）往往失效。目前，基于基因共享网络（Gene-sharing Network）的方法已成为病毒分类的金标准。

同时，病毒不仅仅是“寄生者”，它们还经常携带宿主来源的代谢基因（AMGs）来增强宿主的代谢能力（如光合作用、碳代谢等）以利于自身复制。精准识别这些功能基因，是将病毒与生态系统功能联系起来的关键。

本篇将重点介绍两款重量级工具：vConTACT2（用于病毒分类构建）和 DRAM-v（用于病毒功能及AMG注释）。

前置步骤：基因预测 (Gene Prediction)

无论是分类还是功能注释，大多数工具都需要蛋白序列作为输入。因此，我们首先需要从vOTUs核酸序列中预测出编码基因。

工具：Prodigal (使用 -p meta 模式)。

用法：

prodigal -i vOTUs.fasta -a vOTUs_proteins.faa -d vOTUs_genes.fna -o vOTUs.gff -p meta

-i vOTUs.fasta：指定输入文件，这里是vOTUs.fasta。

-o vOTUs.gff：输出基因的坐标信息，格式为GFF。

-d vOTUs_genes.fna：输出基因的核苷酸序列。

-a vOTUs_proteins.faa：输出基因的氨基酸序列。

-p meta：指定预测模式为宏基因组模式，默认是single模式。

我们主要需要vOTUs_proteins.faa（蛋白序列）作为后续输入。

模块一：病毒物种分类注释 (Viral Taxonomy)

工具介绍：vConTACT2

vConTACT2 是目前国际病毒分类委员会（ICTV）广泛认可的病毒分类工具。它不依赖单一标记基因，而是通过计算两个病毒基因组之间共享的基因簇（Protein Clusters, PCs）数量，构建全基因组层面的相似性网络。

• 核心作用： ○ 将你的vOTUs与已知病毒数据库（如RefSeq）进行聚类。 ○ 基于网络拓扑结构，将病毒划分到属（Genus）或科（Family）水平的分类单元（Viral Clusters, VCs）。

环境部署

vConTACT2 依赖较多，安装时需格外注意。

# 1. 安装
mamba create -n vcontact2 -c bioconda -c conda-forge vcontact2
conda activate vcontact2

# 2. 数据库下载 (非常关键，必须匹配)
# 下载RefSeq原核病毒数据库 (ProkaryoticViralRefSeq)
wget https://bitbucket.org/MAVERICLab/vcontact2/downloads/ProkaryoticViralRefSeq201-Merged-DB.tar.gz
tar -xvf ProkaryoticViralRefSeq201-Merged-DB.tar.gz

软件核心用法

vConTACT2 需要两个核心输入：蛋白序列文件 和 基因与基因组的对应映射文件。

数据准备：

由于输入格式要求严格，建议先按照以下格式整理（假设已有 vOTUs_proteins.faa）：

1. 基因组蛋白文件 (proteins.faa)：包含所有vOTUs的蛋白序列。
2. 基因-基因组映射文件 (gene_to_genome.csv)：两列，无表头。第一列是基因ID，第二列是基因组ID（Contig ID）。

# 运行 vConTACT2
vcontact \
    --gene2genome gene_to_genome.csv \           # 映射文件
    --rel-mode 'Diamond' \                       # 使用Diamond进行快速比对
    --db 'ProkaryoticViralRefSeq201-Merged' \    # 指定下载的数据库目录
    --proteins proteins.faa \                    # 输入的蛋白序列
    --output-dir ./vcontact2_output \            # 输出目录
    --threads 16

结果解析与可视化

运行结束后，./vcontact2_output 目录下会生成大量文件，重点关注以下几个：

A. genome_by_genome_overview.csv (最核心的分类结果表)

这是文本形式的分类结果，告诉你每个vOTU归到了哪个类。

示例数据：

结果解读：

VC(Viral Cluster) : 近似于“病毒属”水平的聚类编号。如果你的vOTU和参考数据库中的病毒分到了同一个VC（如VC_102），且该VC中有已知分类的病毒（如Lectovirus），则可以推断你的vOTU属于该属。

VC_Status：Clustered：成功聚类，置信度较高。

Singleton：该病毒自成一类，与其他任何病毒（包括数据库中的）都不相似，可能是新的病毒属。

Outlier：与某些病毒有联系，但联系不够紧密，无法归入任何VC。

Taxon：如果同VC中有已知RefSeq病毒，这里会显示其分类信息。

B. c1.ntw(网络文件)

作用：这是构建网络图的原始数据。

可视化方法：

a. 打开软件 Cytoscape。

b. 导入网络文件 c1.ntw。

c. 导入属性文件 genome_by_genome_overview.csv（作为节点属性）。

d. 设置节点颜色：将“RefSeq”病毒设为灰色，将“My_vOTUs”设为红色。

e. 结果看点：你会看到你的红色节点如果和灰色的RefSeq节点紧密连接在一起，说明分类明确；如果红色节点聚集在一起形成独立的“孤岛”，说明你发现了一个全新的病毒类群。

模块二：病毒功能注释与AMG挖掘 (Functional Annotation)

工具介绍：DRAM-v

虽然我们可以用eggNOG-mapper做通用注释，但专门针对病毒的 DRAM-v (Distilled and Refined Annotation of Metabolism - viral)是目前更优的选择。

核心优势：

专门针对AMG设计：它不仅注释基因功能，还通过一套严格的规则（基于基因在基因组末端的距离、病毒标志基因的存在等）对AMG进行打分，剔除假阳性。

可视化极佳：提供“蒸馏”（Distill）功能，直接生成代谢通路热图。

环境部署

DRAM 的数据库配置非常庞大（通常需要100GB+），请预留足够时间和空间。

# 1. 安装
mamba create -n dram -c bioconda -c conda-forge dram
conda activate dram

# 2. 配置数据库 (这是最耗时的一步)
DRAM-setup.py prepare_databases \
    --output_dir /path/to/dram_db \
    --kofam_hmm_loc /path/to/kofam_profiles.hmm \ # 可选，提高KEGG精度
    --threads 16

软件核心用法

DRAM-v 的运行分为两步：注释（Annotate）和蒸馏（Distill）。注意：DRAM-v需要输入原始Contigs（为了计算基因位置）和Prodigal预测的基因位置信息。

Step 1: 注释 (Annotate)

DRAM-v.py annotate \
    -i vOTUs.fasta \                     # 输入病毒Contigs FASTA
    -v vOTUs_affi_contigs.tab \          # (可选) 病毒与其宿主的关联表，若无除去此参数
    -o dramv_output \                    # 输出目录
    --min_contig_size 5000 \             # 建议过滤短序列
    --threads 16

(注：DRAM-v内部会重新调用Prodigal，也可以通过参数指定已*(注：DRAM-v内部会重新调用Prodigal，也可以通过参数指定已有的GFF文件)

Step 2: 蒸馏 (Distill)

这一步将复杂的注释表转化为可读性强的汇总表。

DRAM-v.py distill \
    -i dramv_output/annotations.tsv \    # 上一步生成的注释表
    -o dramv_distill_output              # 汇总输出目录

结果解析

A. amg_summary.tsv (AMG汇总表 - 最重要)

这个表格列出了所有被判定为潜在AMG的基因及其可信度。

示例数据：

结果解读：

• header：该基因所属的代谢通路（如光合作用、糖酵解）。
• auxiliary_score(1-5) :重点关注。DRAM-v根据基因邻域环境给出的打分。 Score 1-2：高置信度AMG。表示该代谢基因周围有明显的病毒标志基因（如衣壳蛋白），且不在基因组末端（排除宿主污染的可能性）。 Score 4-5：低置信度。可能位于Contig边缘，或是单纯的宿主污染片段。
• amg_flags：标记可能的警告信息。V 表示该基因附近有病毒特异性基因。

B. product.html (代谢热图)

作用：这是一个交互式的HTML文件。

怎么看：

它将病毒按行排列，代谢模块（如碳固定、氮代谢、硫代谢）按列排列。

格子颜色深浅：表示该病毒基因组中包含该代谢通路基因的覆盖度。

实战意义：如果你看到某组病毒在“Photosynthesis（光合作用）”模块下有高亮色块，说明这组病毒可能携带psbA等基因，是典型的“辅助代谢”证据。

常见问题与避坑指南

1. vConTACT2 结果全是 Singleton？

○ 原因：环境病毒（如土壤、深海）通常在数据库中缺乏参考序列，这是正常现象。

○ 对策：虽然没有分类名，但你可以根据网络图，把聚在一起的Unknown vOTUs定义为一个新的Candidate Genus（候选属）。

1. DRAM-v 找不到任何 AMG？

○ 正常吗？：对于大多数噬菌体，找不到AMG是正常的。AMG通常富集在特定环境（如海洋透光层、特定营养循环活跃区）。

○ 检查：如果你的样本是人肠道，AMG确实相对较少；如果是海洋样本，通常能找到光合作用或磷代谢相关AMG。

1. 硬件资源不足怎么办？

○ vConTACT2和DRAM-v都非常消耗内存（32GB起步，建议64GB+）。如果本地服务器跑不动，建议使用精简版数据库或去云平台运算。

本章小结

通过本章的分析，我们的vOTUs已经有了“名分”和“职业”：

1. 利用 vConTACT2，我们构建了病毒家族图谱，识别了它们与已知病毒的亲缘关系。
2. 利用 DRAM-v，我们深入挖掘了病毒基因组中的“暗物质”，特别是识别出了高置信度的辅助代谢基因（AMGs），揭示了病毒操纵宿主代谢的潜在机制。

至此，我们对病毒本身的分析已经比较透彻。但病毒离不开宿主，“这些病毒到底感染谁？” 是宏病毒组分析中最后一块、也是最难拼上的拼图。

在下一篇文章中，我们将详细拆解 病毒宿主预测 (Virus-Host Prediction) 流程，介绍如何利用 CRISPR spacers、序列同源性和k-mer频率等多维证据，锁定病毒的宿主目标。

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