宏病毒组分析(四)：基于 iPHoP 的宏病毒组宿主预测实战指南

在上一篇文章中，我们通过 vConTACT2 和 geNomad 成功给病毒“上了户口”，知道了它们的分类学地位。但是，作为严格寄生的生物实体，病毒必须依赖宿主才能生存和繁衍。“这些病毒感染谁？” 是解析生态网络、理解病毒生态功能最关键的一环。

这篇教程将接续上一篇关于病毒分类学（vConTACT2/geNomad）的内容，带你进入宏病毒组分析中最具挑战性的环节——宿主预测。

我们将深入探讨iPHoP（Integrated Phage Host Prediction）这个集大成者的工具，并详细拆解其背后的逻辑、操作流程及结果解读。

宿主预测的三大主流策略

在动手之前，我们需要理解这些工具的判断依据。这就像刑侦破案，需要不同维度的“证据”：

1. 序列同源性比对 (Homology-based)
   • 原理： “长得像就是一家人”。如果病毒序列与宿主基因组中有高度相似的片段（如原噬菌体区域、tRNA等），则提示存在感染关系。
   • 代表工具： BLASTN, Diamond。
   • 优点： 直观，准确度尚可。
   • 缺点： 对未知病毒（数据库中无近亲）效果差。
2. CRISPR 间隔区匹配 (CRISPR Spacer Matching)
   • 原理： “犯罪记录”。细菌的 CRISPR 系统会记录曾入侵过的病毒片段（Spacer）。如果病毒基因组能匹配上某细菌的 Spacer，这是最强有力的感染证据（金标准）。
   • 代表工具： CRISPRCasTyper, MinCED。
   • 优点： 准确率极高（False Positive 极低）。
   • 缺点： 许多细菌没有 CRISPR 系统，或者 Spacer 库未更新，导致召回率（Sensitivity）低。
3. 基因组特征/机器学习 (k-mer frequency / Machine Learning)
   • 原理： “方言口音”。病毒为了适应宿主，其密码子使用偏好（Codon Usage）或短序列频率（k-mer）会逐渐与宿主趋同。
   • 代表工具： WIsH, RaFAH, vHULK。
   • 优点： 能预测全新病毒，不依赖数据库比对。
   • 缺点： 假阳性率相对较高，需要高置信度阈值过滤。

集大成者 iPHoP 详解与部署

iPHoP (Integrated Phage Host Prediction) 不是一个单一的算法，而是一个流程框架（Pipeline）。它整合了上述多种方法（包括 Blast, CRISPR, WIsH, PHP, RaFAH 等），通过随机森林分类器给出一个综合评分，大大提高了预测的准确度和广度。

环境部署 (Installation)

iPHoP 依赖较多，强烈建议使用 mamba 进行安装，以避免依赖冲突。

安装步骤：

# 1. 创建环境 (推荐使用 mamba，速度快)
mamba create -n iphop -c conda-forge -c bioconda iphop python=3.9

# 2. 激活环境
conda activate iphop

# 3. 检查是否安装成功
iphop --version
# 输出类似：iPHoP version 1.3.2 即为成功

数据库配置 (The Biggest Hurdle)

这是最耗时的一步。iPHoP 依赖一个庞大的宿主基因组数据库（包含 GTDB 的代表性基因组）。

# 1. 创建数据库存放目录
mkdir iphop_db
cd iphop_db

# 2. 自动下载并构建数据库 (注意：需保持网络畅通，耗时较长)
# 该命令会自动下载最新数据库并解压配置
iphop download --db_dir .

# 注意：如果是服务器网络受限，可以本地下载 tar.gz 包后上传至服务器解压
# 官方数据源通常很大，解压后会包含 Sept_2021_pub 等文件夹

软件实战与结果解析

假设我们手头有一份宏病毒组组装好的病毒序列文件：vOTUs.fasta。

准备数据

• 输入数据： vOTUs.fasta (FASTA 格式，建议先剔除短于 5kb 的序列，以提高预测准确性)。
• 宿主数据： iPHoP 默认使用其内置的庞大数据库（包含约 20 万个细菌/古菌基因组）。 ○ 进阶技巧： 如果你有自己样本对应的宏基因组组装出的 MAGs(Metagenome Assembled Genomes) ，可以将 MAGs 加入预测库，特异性会更高。本教程演示使用默认数据库。

运行命令

# 基本运行命令
# --fa: 输入的病毒序列
# --db_dir: 刚才下载好的数据库路径
# --out_dir: 结果输出目录
# --num_threads: 线程数 (建议设高一点)

iphop predict \
  --fa vOTUs.fasta \
  --db_dir /path/to/iphop_db/Sept_2021_pub_rw/ \
  --out_dir iphop_results \
  --num_threads 24 \
  --min_score 90 

--min_score 90: iPHoP 会给每个预测打分（0-100）。通常 90分 被认为是高置信度的阈值，低于 90 的结果建议丢弃。 --no_qc: 如果你的输入序列已经经过严格质控（如 VirSorter2 + CheckV），可以加上此参数跳过 iPHoP 自带的 QC，节省时间。

运行过程监控

运行开始后，屏幕会滚动显示各模块的进度：

1. Blastn: 进行核酸水平比对。
2. CRISPR: 搜索 CRISPR spacer 匹配。
3. WIsH/PHP: 计算 k-mer 距离。
4. Integration: 整合所有证据，计算综合得分。

结果数据全解析

程序运行完毕后，iphop_results 目录下会有多个文件。我们需要重点关注的是 Host_prediction_to_genus_m90.csv (文件名可能略有不同，取决于版本，通常含 genus 和 m90)。

结果文件示例

让我们打开 CSV 文件，典型的内容如下：

怎么看结果？(Result Interpretation)

• Virus_ID: 你的病毒序列名称。
• Host_genus: 预测出的宿主属名（Genus level）。iPHoP 主要精确到属水平，种水平（Species）预测通常不稳健。
• Confidence_score: 置信度得分。 ○ > 95: 极高可信度。通常有 CRISPR 或强同源性证据。 ○ 90 - 95: 高可信度。通常由多种方法共同支持。 ○ < 90: 如果你没设置过滤参数，可能会看到低分结果，建议仅作参考或剔除。
• List_of_methods: 支撑该预测的证据来源。 ○ CRISPR: 最硬的铁证。即便只有这一个证据，分数也会很高。 ○ Blast: 序列相似性。 ○ WIsH/RaFAH: 序列特征匹配。通常单独出现时分数较低，需结合其他方法。

结果是否正常？(Quality Control)

运行结束后，通过以下几点判断结果是否正常：

1. 预测率（Prediction Rate）：
   • 正常范围： 对于复杂的环境样本（如土壤、海洋），通常 10% - 40% 的病毒能预测到宿主。
   • 异常情况： 如果预测率低于 1%，可能是数据库未正确加载，或者你的病毒序列太短（<5kb），特征不明显。
   • 极高情况： 如果是人体肠道样本，预测率可能高达 60-70%，因为肠道微生物数据库非常完善。
2. 宿主分布合理性：
   • 如果你做的是海洋样本，却预测出一堆 Escherichia（大肠杆菌，典型肠道菌）或 Lactobacillus（乳酸菌），这通常是假阳性或污染。
   • 正常的海洋样本应该预测出 Prochlorococcus（原绿球藻）或 Pelagibacter 等宿主。

总结

通过 iPHoP，我们将孤立的病毒序列与复杂的微生物群落联系了起来。

核心流程回顾：

1. 准备： mamba 安装 iPHoP，下载数百 GB 的数据库。
2. 输入： 质控后的病毒 FASTA 序列。
3. 运行： iphop predict 并设置 score > 90。
4. 解读： 重点看 Host_genus 和 List_of_methods，优先信任 CRISPR 证据。

Next Step for You

现在已经掌握了病毒的身份（分类）和关系（宿主）。为了完成宏病毒组分析的闭环，下一步：计算病毒的丰度并在不同样本间进行差异分析（使用 CoverM 或 Bowtie2）。

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