Chem. Sci. | 基于计算重设计与定向进化的镧系依赖光氧化还原酶用于对映选择性二醇裂解

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研究人员围绕一类镧系依赖的光氧化还原酶（PhotoLanZymes, PLZ）开展研究，该类酶能够在可见光照射下催化二醇底物的自由基C–C键断裂反应。然而，早期版本的PLZ存在两个关键问题：镧系金属结合动力学缓慢以及缺乏对映选择性。

本研究通过结合计算重设计与定向进化策略，对该酶进行系统优化。首先通过调整活性位点结构改善底物结合与金属结合动力学，其次通过实验进化提高对特定对映体的催化效率。最终获得的酶在对映选择性与催化性能上均显著提升，实现了对消旋二醇底物的动力学拆分。该工作表明，将AI辅助蛋白设计与实验进化结合，是构建高选择性人工酶的有效路径。

近年来，蛋白质计算设计取得了显著进展，尤其是在深度学习方法推动下，研究人员能够设计高亲和力结合蛋白与新型结构骨架。然而，相较于结构设计，催化酶的设计仍然更加困难，因为其需要在三维空间中精确排列催化位点并维持适当的构象动态性。

一种重要策略是构建人工金属酶或光酶，即将金属或光敏辅因子嵌入蛋白骨架中，使其在手性环境中实现选择性催化。镧系金属近年来被认为是一类潜力巨大的辅因子，能够驱动多种光氧化还原反应。

此前研究已经构建了基于Ce(III/IV)的PhotoLanZyme，可以在光照下催化二醇裂解，但其对映选择性不足，限制了在不对称催化中的应用。因此，本研究的核心目标是实现对映选择性控制。

方法

研究人员首先对原始酶结构进行计算重设计，通过缩小活性位点空腔来增强底物在催化中心附近的预组织能力。具体而言，通过调整结构域位置并结合AI工具（如RFdiffusion与LigandMPNN）重新设计蛋白序列，同时保持关键配位残基以确保镧系金属结合能力。

随后，对优化后的酶进行定向进化，针对活性位点周围关键残基构建突变库，并通过高通量筛选寻找具有更高对映选择性的变体。结合动力学分析、分子动力学模拟与晶体结构解析，系统解析突变对催化与选择性的影响机制。

结果

计算重设计与催化效率提升

研究首先通过计算方法缩小酶的底物结合腔体。结构分析表明，新设计的PLZ2.0相比原始版本显著减少了空腔体积，从而提高底物定位能力。

实验结果显示，该设计不仅提升了催化效率，还显著加快了镧系金属的结合速度，从原本数小时缩短至数分钟。同时，酶的催化效率提高约100倍，主要源于底物结合能力的显著增强。

图1：PLZ 的重设计与催化效率提升。

初始对映选择性的建立

通过比较不同底物的反应结果，研究人员发现缩小活性位点后，酶开始表现出初步的对映选择性。对于较大底物，PLZ2.0能够区分不同对映体，并产生一定的对映体过量值。

这一结果表明，结构约束在实现手性识别中具有关键作用，为后续进化提供了基础。

图2：通过定向进化提升对底物4的对映选择性。

定向进化提升对映选择性

在定向进化阶段，研究人员对活性位点附近残基进行饱和突变筛选，识别出多个关键突变位点。其中，W85N和V87G突变能够显著提升对映选择性与催化活性。

将两个突变组合后得到的双突变体PLZ2.3表现出最高选择性，其选择性因子显著提升，同时保持良好的催化效率。

动力学机制解析

动力学分析表明，对映选择性的提升主要来源于对其中一个对映体反应速率的显著加快，而对另一个对映体影响较小。这种“选择性加速”机制是实现动力学拆分的关键。

进一步分析发现，不同突变之间存在一定的相互作用（非加性效应），说明酶的结构与功能之间具有复杂耦合关系。

图3：PLZ变体的结构与动力学。

结构解析与分子动力学机制

晶体结构显示，优化后的酶结构与计算模型高度一致，验证了设计策略的可靠性。同时，分子动力学模拟揭示了对映选择性的分子基础：不同对映体在活性位点中形成不同的氢键网络与π相互作用。

其中，关键残基（如N85与R249）能够稳定特定对映体的构象，使其更有利于反应发生，从而实现选择性催化。

图4：利用PLZ2.3对二醇底物4进行动力学拆分。

对映体动力学拆分实验

最终，研究人员利用优化后的酶对消旋底物进行动力学拆分实验。结果显示，其中一个对映体被优先消耗，使剩余底物迅速达到高光学纯度。

尽管对不利对映体仍存在一定反应活性，但该实验已证明该酶具备实际应用潜力。

讨论

本研究展示了一种有效的人工酶优化策略，即将计算设计与实验进化相结合。计算方法用于快速构建具有合理结构基础的候选酶，而定向进化则进一步精细优化催化性能与选择性。

结果表明，通过调控活性位点空间结构，可以显著影响底物定位与反应路径，从而实现对映选择性控制。同时，研究还揭示了蛋白突变之间复杂的协同与拮抗关系，这对于未来理性设计酶具有重要启示。

尽管目前的选择性仍有提升空间，但该研究已成功实现镧系依赖光酶的对映选择性催化，为开发新型光驱动不对称催化体系提供了重要基础。

总体而言，该工作不仅拓展了人工酶设计的能力边界，也展示了AI驱动蛋白设计在催化科学中的巨大潜力。

整理 | DrugOne团队

参考资料

Leiss-Maier, F., Behringer, J., Mustafa, G., Heider, A., Mühlhofer, R., Klein, A.S.S., Groll, M. and Zeymer, C., 2026. Computational redesign and directed evolution of a lanthanide-dependent photoredox enzyme for enantioselective diol cleavage. Chemical Science.

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