Proc. Natl. Acad. Sci. | AI蛋白质结构预测模型对静电相互作用的刻画精度

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近年来，以AlphaFold2、RoseTTAFold、ESMFold和OmegaFold为代表的人工智能蛋白质结构预测模型极大推动了结构生物学的发展。然而，这些模型是否真正掌握了决定蛋白质稳定性的物理化学规律，尤其是静电相互作用和可电离氨基酸残基的空间分布原则，仍缺乏系统评估。研究人员利用一个偶然获得的U1A蛋白突变体作为切入点，发现实验测得的蛋白质结构性质与AI预测结果存在显著差异。进一步通过系统设计数千种序列，在U1A、酰基磷酸酶（ACP）以及人工设计蛋白TOP7三个体系中逐步引入带电残基，全面评估不同AI模型的预测表现。结果表明，尽管AI模型能够较好维持整体折叠构象，却经常预测多个可电离残基被埋藏于疏水核心内部，这与经典蛋白质热力学规律明显矛盾。相比之下，短时间全原子分子动力学模拟能够迅速暴露这些不合理结构，使带电残基重新暴露于溶剂环境。研究人员认为，目前AI模型更多依赖训练数据中的统计模式，而非真正学习蛋白质折叠背后的热力学原理，因此建议在AI预测之后增加短时间分子动力学模拟作为重要的物理验证步骤。

AlphaFold2的出现标志着蛋白质结构预测进入新时代，大量后续模型不断提升预测效率和适用范围，使得仅依据氨基酸序列预测高精度三维结构成为现实。这些模型已经广泛应用于结构解析、功能预测、药物设计和蛋白质工程等多个领域。

与此同时，越来越多研究开始关注这些模型的局限性。例如，它们对于蛋白质动态构象、多构象转换、配体诱导变化以及自由能计算等问题仍存在不足。一项更加基础但长期未被系统研究的问题是，AI模型是否真正理解蛋白质折叠过程中最基本的物理化学规律。

对于绝大多数可溶性蛋白而言，带电或极性残基通常分布在蛋白质表面，而疏水残基则形成内部核心。这种分布源于静电相互作用和溶剂化自由能共同决定的热力学稳定性。如果将带电残基埋藏于疏水核心，会产生巨大的能量惩罚，通常导致蛋白质稳定性下降甚至完全改变折叠方式。因此，带电残基在天然蛋白内部极为罕见，除非形成氢键网络或盐桥加以补偿。

研究人员希望借助实验突变体和大量计算分析，评估当前主流AI模型是否真正学习了这一蛋白质结构形成的基本规律，并进一步探讨如何利用传统物理方法弥补AI模型的不足。

方法

研究人员首先分析一个偶然获得的U1A蛋白突变体，该突变体因四个位点替换错误形成新的结构特征，并通过圆二色谱、核磁共振和分析超速离心等实验验证其真实结构性质。随后，分别利用AlphaFold2、RoseTTAFold2、OmegaFold和ESMFold预测该突变体结构，并比较实验结果与AI预测之间的差异。进一步，在U1A、ACP和TOP7三个蛋白的疏水核心中逐步引入不同数量的Asp、Glu、Lys和Arg等可电离残基，共分析数千种序列，统计残基暴露程度、结构偏离程度、回转半径及模型置信度等指标。最后，对AI预测结构开展全原子显式溶剂分子动力学模拟，观察结构是否能够自动恢复符合物理规律的构象，从而评估AI模型预测的可靠性。

结果

偶然获得的U1A突变体揭示AI预测存在明显偏差

研究最初源于一次实验中的偶然发现。研究人员原计划优化U1A蛋白表面静电相互作用，但由于编号错误，四个带电残基被引入完全不同的位置，其中两个位于蛋白质疏水核心。

实验结果显示，该突变体与天然U1A完全不同。圆二色谱结果表明其α螺旋含量几乎增加一倍；分析超速离心显示天然U1A为单体，而突变体则形成三聚体；核磁共振数据也支持蛋白质发生了明显构象变化。

然而，无论采用AlphaFold2、RoseTTAFold2、OmegaFold还是ESMFold，预测得到的结构几乎都与天然U1A完全一致，主链偏差不足1 Å。更令人意外的是，两个新增带电残基仍被预测埋藏于疏水核心，没有形成盐桥或氢键，也没有诱导整体折叠发生改变。这与蛋白质热力学基本规律明显不符。

图1: 实验表明U1A突变体形成新的三聚体结构，而AI模型仍预测天然折叠构象。

AI模型能够容忍大量埋藏带电残基

为了进一步判断这种现象是否属于偶然，研究人员在U1A疏水核心十二个位置逐步引入Asp、Glu、Lys或Arg，并系统分析不同数量突变后的预测结果。

研究发现，当仅有少量突变时，所有模型均保持天然折叠。随着带电残基不断增加，不同模型开始表现出明显差异。

Transformer模型（OmegaFold、ESMFold）在大约六个以上带电突变后开始逐渐打开结构，使带电残基暴露于溶剂环境，同时整体结构逐渐偏离天然构象。

相比之下，AlphaFold2和RoseTTAFold2则表现出更强的结构保持倾向。即使十二个核心残基全部替换为Asp或Glu，模型仍坚持预测接近天然折叠，只是简单将多个带电侧链继续埋藏于疏水核心。对于体积较大的Lys和Arg，模型虽然略微扩大蛋白内部空间，但整体拓扑几乎保持不变。

更加值得关注的是，在如此明显违反物理规律的情况下，AlphaFold2给出的pLDDT仍保持90分以上，说明模型对于这些明显不合理结构依然具有很高信心。

图2: AI模型预测U1A疏水核心可容纳大量带电残基，违反经典蛋白质稳定性规律。

不同AI模型表现出不同预测策略

进一步比较不同模型后，研究人员发现，深度学习模型和Transformer模型实际上遵循两种不同预测策略。

AlphaFold2和RoseTTAFold2更倾向于保持原始折叠结构，即使局部出现明显不合理的静电环境，也尽量维持整体拓扑。这意味着模型更多依赖训练数据中已有结构模式，而不是重新评估蛋白质热力学稳定性。

OmegaFold和ESMFold则更加依赖序列本身。当带电突变数量增加后，它们逐渐放弃天然折叠，生成更加开放的新构象，使带电残基重新暴露于溶剂环境。虽然预测结果未必正确，但至少开始反映静电作用带来的结构变化趋势。

研究人员认为，两类模型分别体现了"结构记忆"和"序列推断"两种不同建模方式，各有优势，也各有局限。

图3: 深度学习模型与Transformer模型在处理带电突变时表现出不同预测机制。

类似问题在ACP蛋白中再次出现

为了验证这一现象具有普遍性，研究人员进一步分析另一种天然蛋白——酰基磷酸酶。

结果与U1A高度一致。AlphaFold2和RoseTTAFold2依然倾向保持天然折叠，将多个Asp或Glu继续埋藏于蛋白内部；Transformer模型则随着突变增加逐渐打开结构，提高带电残基暴露程度。

对于体积更大的Lys和Arg，两类模型都会适当扩大蛋白核心空间，但AlphaFold2仍维持整体拓扑，而Transformer模型则更容易产生较大构象变化。

说明AI模型忽略静电热力学规律并非个例，而是在不同天然蛋白中普遍存在。

图4: ACP蛋白分析进一步验证AI模型容易错误埋藏带电残基。

人工设计蛋白TOP7揭示AI模型泛化能力不足

随后，研究人员进一步分析人工设计蛋白TOP7。由于TOP7不存在天然同源序列，因此几乎没有MSA信息可供模型利用，更能反映AI模型真正泛化能力。

实验发现，Transformer模型在带电突变增加后迅速放弃天然构象，产生较大结构变化；AlphaFold2虽然也出现一定调整，但仍然维持较紧凑整体折叠，并继续容纳大量带电残基进入疏水核心。

研究人员认为，对于人工设计蛋白，深度学习模型更加依赖训练集中已有结构记忆，因此难以真正评估此前未出现的新序列。

图5: TOP7分析说明AI模型对未知蛋白序列的物理泛化能力仍然有限。

分子动力学能够迅速识别AI预测中的物理错误

最后，研究人员利用CHARMM和AMBER两套经典力场，对AlphaFold2预测结构开展全原子显式溶剂分子动力学模拟。

结果十分一致。天然蛋白在模拟过程中始终保持稳定；而所有包含埋藏带电残基的AI预测结构，仅经过不到1 ns模拟便开始发生明显构象调整，多个带电残基迅速暴露至蛋白表面，同时整体RMSD明显增加。

这一现象在U1A、ACP和TOP7三个体系中均可重复观察，而且两套独立力场得到一致结果，说明这些结构问题并非模拟误差，而是真正违反物理规律。

研究人员据此提出，几十纳秒的短时间分子动力学模拟即可作为AI预测的重要质量控制工具，有效识别明显违反热力学原则的预测结果。

图6: 分子动力学模拟快速暴露AI预测结构中埋藏带电残基的不合理性。

图7: 基于CHARMM和AMBER力场的分子动力学验证AI预测结构的物理合理性。

讨论

本研究首次系统证明，目前主流AI蛋白质结构预测模型虽然能够准确恢复天然蛋白整体折叠，却尚未真正掌握蛋白质静电相互作用背后的物理化学规律。特别是在非天然序列或大量带电突变情况下，模型往往优先保持训练数据中的结构模式，而不是重新寻找符合热力学稳定性的构象。

研究人员认为，这种现象反映了当前AI模型仍然主要依赖统计学习，而非真正理解蛋白质折叠自由能。对于天然蛋白，由于训练数据丰富，模型能够获得极高预测精度；但面对训练集中极少甚至不存在的新序列时，其物理泛化能力明显不足。

另一方面，Transformer模型虽然整体预测精度略低，但面对大量突变时更容易探索新的构象空间，因此在一定程度上比深度学习模型更接近真实物理行为。然而，两类模型都无法完全解决带电残基埋藏问题，说明目前AI结构预测距离真正建立统一物理模型仍有一定距离。

研究人员最后建议，在蛋白质设计、突变预测以及AI生成新蛋白等应用中，不应仅依据AI预测结构进行判断，而应增加几十纳秒的全原子分子动力学模拟作为标准验证流程。如果预测结构在短时间模拟中迅速发生较大构象变化，则说明其可能违反基本热力学规律，需要进一步修正或重新设计。

总体而言，本研究不仅揭示了当前AI蛋白质结构预测模型的重要局限，也提出了一套简单、可推广的物理验证策略，为未来将人工智能预测与基于物理的结构优化相结合提供了重要思路。

整理 | DrugOne团队

参考资料

G.I. Makhatadze,The accuracy of electrostatic interactions captured by AI protein structure prediction models, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 123 (29) e2609610123, https://doi.org/10.1073/pnas.2609610123 (2026).