原代细胞培养过程中的常见问题

从生物体取出组织或器官，经酶的消化或其他方法得到单个细胞，并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。原代细胞寿命和代次有限，培养条件需根据细胞类型优化，它与生物相关性高，保留体内组织遗传特性。使用原代细胞能避免动物实验方面的伦理学异议，尽管减少了动物实验的成本，但原代细胞的分离和成本还是很高，在原代细胞培养过程中我们希望尽量减少异常问题的发生。一般问题主要有细胞漂浮、不贴壁、生长缓慢等问题，大部分可以从消化传代、培养基的使用、细胞污染方面考虑。

一、细胞漂浮

1. 操作不当导致贴壁性差或细胞本身贴壁性不强

解决方法：PLL、胶原、0.1%明胶包被，可增强细胞吸附性。

2. 培养器皿：材料表面吸附能力不足

解决方法：使用特殊处理的培养材料。

3. 细胞对温度敏感、预冷收缩

解决方法：将环境维持在25℃以上，培养温度维持在37℃，细胞换液传代过程中预热培养基。细胞停留在培养箱外的时间不能太长，尽量减少拿出拿进培养箱的次数。

4. 血清浓度低、培养液中贴壁因子较少

解决方法：增加血清量，血清含量不低于5%。当然也有部分不需要加血清的细胞，或者加了血清会促进分化的细胞，不适合提高血清浓度。

5. 运输导致细胞聚团脱落

解决方法：保证运输温度在25℃以上，包好缓冲棉减少震荡。温度低，加暖宝宝，温度高加冰袋。

二、细胞传代不贴壁

1. 细胞脆弱、易受损伤，传代过程中吹打离心消化

解决方法：

（1）控制处理过程，4℃或者使用温和的消化酶消化，减少损伤

（2）尽量避免消化后的细胞直接用于实验（可能还有消化酶的残留）

2. 酶消化对细胞表面蛋白损伤

解决方法：降低酶浓度0.05%或者不使用胰酶。

3. 缺少细胞外基质，吸附性不强

解决方法：1）包被接种，PLL、胶原、明胶纤粘蛋白等。2）使用特殊处理材料培养。

4. 诱发细胞凋亡、漂浮

解决方法：更换培养液（培养液配制、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因）、调整细胞状态、添加抑制凋亡试剂，比如ROCK 抑制剂等。

5. 传代比例过大，接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质

解决方法：推荐传代比例1传2，细胞传代24小时之内，最好不要晃动，以免影响贴壁。

三、其他常见问题

Q1：如何判断原代细胞衰老了？

A：(1）形态学的观察，细胞突起变大、或细胞扁平；

   (2）β半乳糖苷染色判断细胞是否衰老；

   (3）增殖速率明显下降；

   (4）对相关的标志物进行检测。

Q2：如何确保分离的原代细胞的活性

A：(1）组织离体时间不能太久；

   (2）低温冰上分离，但也不能直接从-80℃冰箱上取出一块冰；

   (3）无菌操作体系；

   (4）消化酶的浓度和消化时间的把控。

Q3：如何让原代细胞一直保持增殖能力？

A：原代细胞传代有限，我们可以通过构建永生化细胞株使其获得无限增殖的能力，即转变为永生化细胞系。

Q4：原代细胞一般第几代做实验比较好？

A：5代以内，3代最好。

Q5：原代细胞可以冻存吗？冻存复苏后活率差的原因是什么？

A：这取决于细胞的类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。冻存后复苏活率低需要考虑冻存前细胞活性，细胞量以及冻存体系，冻存体系是指用的含血清的冻存液，还是一步冻存液，不同冻存方法对应的操作方法不同需要注意。

Q6：贴壁的原代细胞很难消化是怎么回事？

A：细胞初代培养时在细胞皿上培养的时间过长，解决方法可以将酶的浓度降低，37℃培养箱中延长消化时间，或者分步消化。

Q7：提取原代细胞经常发生污染可以怎样改善？

A：首先要确保细胞分离实验室是否存在细菌污染，如果存在问题，需要将实验室进行消毒，培养箱灭菌，检查试剂耗材是否可用，第二个就是注意无菌操作，保证试剂、剪刀镊子等无菌，第三是可以在培养液中加抗生素，双抗、两性霉素等。

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作者：海星生物

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