项目文章 | 丙酸盐通过调节灰霉菌的新陈代谢抑制灰霉菌活性

2023年6月1日，华东师范大学朱品宽教授课题组，在农林科学1区Top期刊Food Chem (IF=9.231)上会在线发表题为“Propionate poses antivirulence activity against Botrytis cinerea via regulating its metabolism, infection cushion development and overall pathogenic factors”文章阐明了丙酸盐通过调节灰霉菌的新陈代谢抑制灰霉菌活性，因此丙酸钙盐是减轻灰霉病对果实的损害的可持续方法。本研究的结果可能对制定防治措施和食品添加剂提供了有益的信息。文中的转录组信息在上海元莘生物进行测序。

研究背景

Botrytis cinerea（灰霉菌）是一种典型的坏死病原体，可能对世界范围内的作物造成严重损害；灰霉菌会分泌混合毒力因子（效应蛋白、毒素和参与ROS产生的酶），杀死宿主细胞；由于其毒性方面的多功能性，灰霉菌可以很好地适应感染周期，并能感染各种不同植物品种。感染初期，灰霉菌会产生多细胞附着体的结构，即感染垫（IC），历史研究发现IC结构可分泌对植物渗透和定植重要的真菌效应因子，包括植物毒素、ROS、CAZYs和植物细胞死亡诱导蛋白；cAMP和MAPK信号通路成分已被证明是介导IC发展和充分毒性所必需的。

合成杀菌剂常用于果实作物灰霉病的防治，但也会对环境造成污染，同时使病原菌产生抗性。植物源成分可以诱导果实免疫，实现作物保护目的，但现阶段研究相对缺乏。丙酸是自然中丰富的碳源，真菌可以通过甲基柠檬酸循环利用丙酸，但丙酸摄入过多可能导致中间产物积累（如丙酰辅酶a和甲基异柠檬酸），这些中间产物会在初级代谢中抑制丙酮酸脱氢酶复合物和琥珀酰辅酶a合成；因此丙酸可以通过剂量依赖的方式表现出抑菌或杀菌作用；因此丙酸盐可能会是传统合成杀菌剂的替代，用于保护新鲜水果作物免受真菌病原体的感染腐败。

本研究发现，即使是亚致死丙酸钙（calcium propionate，CP)剂量，也可以消除灰霉菌的IC结构和毒力，在收获前应用CP处理可以预防采集后储存期间真菌感染引起的腐败；因此推测丙酸不仅能抑制真菌的生长，还能干扰真菌的毒力；本研究旨在研究丙酸对灰霉菌感染的影响机制，揭示其分子机理，为丙酸作为合成杀菌剂的绿色替代品给出理论依据。

研究思路

本研究的主要目的是探究CP对B. cinerea的影响机制。通过转录组学的方法，研究CP处理下，对B. cinerea基因组范围内转录的重构情况，以及相关代谢途径黑致病因子的变化情况。实验使用CP的亚致死剂量(0.2%)对B. cinerea进行处理，并对转录组进行测序和分析，以确定基因组范围内的变化。

研究结果

1.亚致死剂量下相对对照组，灰霉菌会呈现代谢和发育的缺陷，并在转录本表达上会有较大的变化

CP会抑制菌落生长，0.2 % CP水平下，灰霉的芽管保持生长，但与对照样品相比生长速度较慢。主要表现IC(感染垫)形成失败和黑色素积累失败，因此温和剂量的丙酸盐也会对真菌的发育和代谢造成干扰。RNA-seq结果显示：共找到1417个差异表达基因（DEGs），其中784个基因上调和633个基因下调。富集结果显示：CP处理上调了脂肪酸的代谢途径，但普遍抑制了与毒力相关的分子功能。

CP处理上调了丙酸代谢相关的基因，甲基柠檬酸循环（MCC）中的标志性基因2-MCS、2-MCD和2- MICL均显著上调，MCC通路上调会产生较多的丙酮酸和琥珀酸；同时结合实验发现，外部CP和琥珀酸处理结果显示：添加琥珀酸可以抑制灰霉菌IC结构的产生和毒性。

2.CP处理会导致过氧化物酶体上调

转录组数据也显示CP处理后，过氧化物酶体相关基因上调；研究分析了表达过氧化物酶体膜蛋白BcPEX3与红色荧光蛋白（RFP）融合的转基因菌株，CP处理后的样品显示出以BcPEX3-RFP信号标记的球形囊泡的存在增强。亚细胞分析结果与转录组数据相吻合，即过氧化物酶体发生和活性相关基因的表达可能在丙酸代谢反应中显著升高。

3. CP处理会抑制黑色素的合成

转录组结果中黑色素合成相关基因显著下调，黑色素的合成与生殖结构的形成有关，包括灰色的分生孢子和褐色菌核；用GFP标记的黑色素生物合成酶BcBRN2的转基因菌株，结果显示CP处理后的黑色素BcBRN2-GFP荧光信号在IC端的聚集显著降低，进一步支持了这一发现；但孢子的形成没有受到影响；综上，丙酸代谢会对IC形成和黑色素的生物合成有负面影响，但对生殖发育阶段没有负面影响。

4.抑制灰霉菌感染垫的相关基因和主要毒力因子

激活丙酸代谢会抑制IC的发展；结合本次CP-DEGs和已经发表的IC-DEGs（IC发展相关的基因）：对CP-down和IC-up DEGs共同基因（204个）进行富集，富集通路与次级代谢、毒素和黑色素合成、外源多糖降解/修饰、毒力等类别显著相关；CP-up和IC-up共同基因（143）富集到脂肪酸和碳水化合物的代谢。

灰霉菌IC与分泌大量的毒力因子显著相关，CP处理系统地下调了编码毒力因子的基因，与植物细胞壁降解及植物细胞死亡诱导蛋白相关基因均受到显著抑制；活性氧（ROS）也是感染期间的毒力因子，使用DAB染色发现，CP处理的菌丝染色强度明显较弱。综上，CP处理通过抑制IC发育和毒力基因活性进而抑制灰霉菌的发育，降低真菌感染宿主的能力。

结果讨论

研究发现丙酸钙（CP）可以有效抑制灰霉菌的生长发育和毒性，其作用机理是通过下调与感染垫相关的毒性代谢物编码基因，降低灰霉菌的感染力，并引起灰霉菌菌丝生长的损伤。CP处理还可以增强灰霉菌中过氧化物酶体相关基因的表达水平，从而减轻代谢和与宿主或环境相互作用产生的氧化应激。此外，本研究发现额外的琥珀酸可以与CP处理等效，作为鉴定感染发育过程的分子标记，同时CP处理可以导致感染初期的菌丝色素沉积缺陷，使得病原菌可以被植物免疫反应识别。因此，CP处理是一种可持续的方法来减轻灰霉病对果实的损害，并为制定防治措施和食品添加剂提供了有益信息。综上，本研究表明CP具有控制灰霉病的潜力，并揭示了丙酸代谢在感染垫结构发育和整体毒力方面的主调控作用。

参考文献

Zhu C, Tang Y, Ren D, Ren W, Xue Y, Suthaparan A, Li J, Wang Y, Xu L, Zhu P. Propionate poses antivirulence activity against Botrytis cinerea via regulating its metabolism, infection cushion development and overall pathogenic factors. Food Chem. 2023 Jun 1;410:135443. doi: 10.1016/j.foodchem.2023.135443. Epub 2023 Jan 13. PMID: 36680882.