【文献解读】冷冻电镜技术揭示Prime editing编辑过程关键分子机制

日本东京大学的科研团队在Nature上发表题为Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor的研究文章，影响因子50.5。该研究使用冷冻电镜技术（cryo-EM）展示了SpCas9-M-MLV RT∆RNaseH - pegRNA -target DNA复合物在多种状态下的低温电镜结构，设计了pegRNA变体和Prime editor变体，并对M-MLV RT进行截短和融合，成功开发了一种更小尺寸的Prime editor变体（PECO-Mini），为开发多功能Prime editing工具箱铺平道路。

Prime editing是一种基于CRISPR/Cas系统改进的基因编辑技术，在基因组的靶位点处实现精准的片段插入、删除及碱基的任意替换，具有更高的精确性和更低的误差率，目前已被广泛应用于人类细胞和各种生物中植入精确的突变。然而，由于缺乏结构信息，Prime editor识别PBS-NTS异双工启动和终止RTT（逆转录模板）序列逆转录的机制仍然知之甚少。为此，研究人员在多种状态下测定了Prime editor的冷冻电镜（cryo-EM）结构，为理解这一创新的基因组工程系统提供了一个结构框架。

一、确定Prime editor的结构

研究人员纯化了内源性Prime editor 2（PE2），并使用pegRNA和5 ' - cy5标记的预缺口dsDNA底物进行了体外Prime editing实验，PE2通过RTT序列逆转录生成DNA产物。该实验使用在RTT序列5 '端停止逆转录的pegRNA，与PE2、目标DNA和ddATP混合孵育组装，以控制Prime editor在逆转录终止时停滞，观察其结构形态。初次尝试时可能受样品的异质性影响，无法获得高分辨率的低温电镜密度图。为了克服该问题，研究人员使用改良的pegRNA，减少副产物的产生，并用纯化的无催化活性的SpCas9和工程化的M-MLV RT∆RNaseH（简称RT∆RH）取代PE2，经测试该系统表现出与PE2相当的编辑效率。使用ddATP重建SpCas9-M-MLV RT∆RNaseH - pegRNA -target DNA复合体逆转录终止时的状态，获得整体分辨率为3.0 Å的三维(3D)重建模拟图，并对RTΔRH局部细化得到3.5-Å的局部图，结合这些图谱得到SpCas9-M-MLV RT∆RNaseH - pegRNA -target DNA的完整模型图。

图1 终止状态下Prime editor的低温电镜结构

二、Prime editor的总体结构

低温电镜结构显示，SpCas9与pegRNA的骨架区组装形成核糖核蛋白，并依赖引导RNA和PAM与靶DNA结合，表明pegRNA的3 '延伸区和M-MLV RT不抑制SpCas9对靶DNA的识别。3 '延伸区与NTS在面向SpCas9 RuvC结构域的弱正电荷表面形成RNA-DNA异双工，3-nt PBS碱基对中的核苷酸C103-G115与NTS中的核苷酸dC(- 16*)-dG(- 4*)形成PBS-NTS异双工，6-nt RTT中的核苷酸C98-G102与新合成的(反转录)核苷酸dC1-3dG5在NTS上形成碱基配对，位于RTT 5 '端的U97与NTS中的ddA6配对。除了外围区域外，在密度图中可以清晰地看到RTΔRH，其通过带正电的中心槽与PBS-NTS和RTT合成的DNA异双工结合。M-MLV RT催化基序(YVDD)位于最后一个U97-ddA6碱基对附近，表明该结构捕获了Prime editor刚刚完成RTT序列末端逆转录的状态。

图2 Prime editor的核酸结构

三、逆转录酶在逆转录模板序列的终止点之后的延伸情况

由于M-MLV RT对pegRNA 3 '延伸段的逆转录可以进入骨架区，因此在Prime editing中逆转录的精确终止位点及其终止机制尚不清楚。研究人员通过低温电镜观察到，虽然RTΔRH逆转录一直进行到RTT的末端，但SpCas9和RTΔRH之间有大约10-Å的分离，在支架区域的3 '端，C96与RTΔRH的关键残基形成广泛的相互作用，特别是C96的核糖部位分别与L99和R116形成堆叠和氢键，而G82-C96碱基对与Y64形成堆叠相互作用，表明如果不被ddATP阻止，RTΔRH将继续在RTT之外逆转录进入骨架区域。为了对逆转录终止位点进行生物化学表征，研究人员使用PE2和非接触PE进行了体外Prime editing试验，观察到具有dNTP的逆转录产物始终比具有ddATP的逆转录产物长3个核苷酸，表明PE2和非接触的PE的逆转录并不终止于RTT末端，而是进展到骨架区域的U94。这些结果表明，M-MLV RT将逆转录延伸至RTT上游3个核苷酸的pegRNA的U94，并通过与pegRNA解离而终止逆转录。

Prime editor会诱导骨架衍生的短结合，导致在目标位点处产生非期望的编辑。为了消除这些结合，研究人员试图设计一种带有过度逆转录的修饰支架序列的pegRNA变体，通过修饰U943—C96以匹配目标位点并调节A84—G82以维持茎环结构来设计pegRNA变异体，可以有效地触发pegRNA依赖性逆转录，同时消除支架衍生的短结合。使用野生型pegRNA和三种修饰茎环序列的pegRNA变体进行了体外Prime editing实验，并证实这些修饰不会影响pegRNA依赖性逆转录活性。研究人员还在HEK293细胞中分别使用PE2和PE3系统在五种和四种先前验证的目标条件下评估了Prime editing编辑效率，结果显示，修饰的pegRNA成功地诱导了所需的编辑，频率与野生型pegRNA相当。

图3 Prime editor在终止状态的结构特征和功能分析

四、Prime editor启动逆转录的过程

为了研究引物编辑器如何启动逆转录，研究人员设计了一个pegRNA，允许第一个核苷酸ddA的掺入。使用ddATP重建了SpCas9—RTΔRH—pegRNA—target DNA的起始复合物，成功获得整体分辨率为3.1 Å的三维重建。出乎意料的是，研究人员在这张图中观察到了与RTΔRH对应的密度，表明M-MLV RT在逆转录起始时相对于SpCas9位于一个固定的位置。针对RTΔRH-proximal区域进行局部细化后，得到起始复合物的组成图，并确定RTΔRH的特征Cα原子，将其结构建模为单个刚体的密度图。图片显示，PBS与NTS形成RNA—DNA异双工，并夹在SpCas9的RuvC结构域和RTΔRH之间，RTT 3 '端的U102与ddA1形成碱基对，而其余部分除G97和A101外无序，表明RTT在逆转录前具有灵活性。RTΔRH虽然相对于SpCas9处于固定位置，但与SpCas9和pegRNA的支架区缺乏直接的相互作用。相反，RTΔRH与PBS—NTS异双工形成广泛的相互作用，活性位点位于U102-ddA1碱基对附近。这些结构观察表明，PBS—NTS异双工的位置可能在确定逆转录起始点方面起着至关重要的作用。

为了验证这一假设，研究人员重建了不含RTΔRH的Spcas9—pegRNA—target DNA复合物并试图确定其起始前复合物的cryo - EM结构。考虑到RTT序列的长度可能会限制PBS—NTS异双工的位置，研究人员使用具有长RTT序列的pegRNA进行结构测定，获得了起始前复合物的三维重建，总分辨率为3.2 Å。在密度图中观察到与PBS—NTS异双工相对应的棒状密度，表明PBS—NTS异双工稳定地存在于该表面。对起始前复合物和起始复合物的结构比较表明，PBS—NTS异双工在两种状态下的位置相似。这些结构观察表明，PBS—NTS异双工是面向RuvC结构域形成的，M-MLV RT随后识别并结合该异双工，启动RTT序列的逆转录。

为了捕获Prime editor的延伸状态，研究人员制备了一个带有28-nt RTT的pegRNA，设计用于在第16个核苷酸处用ddATP停止逆转录，并通过冷冻电镜分析其结构。通过3D分类和局部细化，研究人员从3.1 Å分辨率的整体图和6.1 Å分辨率的RTΔRH附近的局部图中获得了延伸复合物(16-nt)的复合密度图，在RuvC结构域表面观察到与长RNA—DNA异双工相对应的密度，其末端结合RTΔRH。起始复合物和延伸复合物之间的结构比较显示，尽管逆转录进展了15 nt, RTΔRH相对于SpCas9的排列基本保持不变，表明在RTT的逆转录过程中，M-MLV RT在起始位点周围保持一致的位置。至此，研究人员提出了一个大胆的猜想：M-MLV RT通过短连接物拴在SpCas9内以将其锚定在起始位点附近，将充分诱导pegRNA依赖性逆转录。为验证这一假设，研究人员设计了两个PE2变异，其中RTΔRH插入G1054和E1055之间或T1068和G1069之间的RuvC结构域，纯化后发现这两个变体具有与野生型PE2相当的逆转录效率。结构比较还显示，由于RTT—合成DNA异双工的形成，PBS—NTS异双工被推向与RTΔRH相反的方向，导致PAM—远端靶DNA双工重排。这些结构和生化观察表明，M-MLV RT在起始位点一致地执行RTT序列的逆转录，RTT—合成DNA异双工沿着SpCas9的纵向表面建立，从而导致PAM—远端靶DNA双链的重排。

图4 多种状态下Prime editor的低温电镜结构

综上所述，本研究通过冷冻电镜(cryo-EM)结构揭示Prime编辑器在多个状态下与SpCas9、M-MLV RT、pegRNA和目标DNA复合物的结构，合理设计了pegRNA变体和Prime editor变体，为Prime editing的逐步机制提供了结构见解，并为开发多功能Prime editing工具箱铺平了道路。