动物行为与光电专题（31）丨光遗传在奖赏相关行为中的应用

利用光遗传学技术，直接兴奋前额叶皮质神经元，可探究其在奖赏中的作用。

动物分组：

自身按杆行为学实验

带有光敏感蛋白ChR2的病毒载体注射后3到4周后进行自身按杆实验。进行正式实验前，每天1次，1次5到10分钟对实验小鼠进行抓握，使小鼠适应实验者，减少不必要的应激反应。实验前一天，将小鼠放入自身按杆行为检测箱30min，使其适应试验环境。实验前两天为基准期(baseline，day1，day2)，每天一次，一次30min，将小鼠置于实验箱(40cm×40cm)，箱内其中一面有两个按杆，左右各一，按杆上方有一指示灯，当按杆被小鼠按下时，指示灯亮起持续1s；随后5天为获得期(acquisition，day3-day7)，小鼠颅顶光纤连接激光发生器，按下其中一个按杆，上方指示灯亮起同时获得1次颅内激光刺激，此按杆定义为活跃按杆(active lever)，另一个按杆为非活跃按杆(inactive lever)，按下非活跃按杆只有指示灯亮起无颅内光刺激；紧接着是为期3天的戒断期(extinction，day8-day10)，无论活跃还是非活跃按杆都只有指示灯亮起，无颅内激光刺激；之后4天为重新获得期(re-acquisition，day11-day14)，按两个按杆指示灯都不再亮，按活跃杆得到一次颅内激光刺激，按非活跃杆则无激光刺激。

激光参数：

除外特别说明，本部分是实验所用激光，以方波形式，参数如下：波长473nm，给光频率25Hz，脉冲数8个，脉冲持续时间3ms，激光强度6-7mW/mm2。激光从激光发生器通过连接线、万向光转子与小鼠颅顶陶瓷基座相连，穿过陶瓷基座内的光纤直接照射到相应脑区，作用于表达在该脑区的ChR2光敏感蛋白。

互换按杆实验

小鼠完成基准期--获得期--戒断期--重新获得期实验后，将原先的活跃与非活跃按杆互换，暨原先活跃按杆变为非活跃按杆，按下此按杆后不再获得颅内激光刺激，而非活跃按杆变为活跃按杆，每按下一次获得一次颅内激光刺激。

不同光刺激频率实验：

为了检验不同激光刺激频率对自身按杆的影响，只改变激光刺激频率，其他参数保持不变，分别以频率从低到高，从高到低两种顺序相隔一天进行自身按杆实验，4种刺激频率(6.25Hz，12.5Hz，25Hz，50Hz)，每一种频率10min，之后换成另一个频率，合计40min，选取每个频率的后5min活跃杆按杆次数代表该频率的作用。

固定比率自身按杆实验

固定比率1：1，1:2，1:4按杆实验检验小鼠对自身按杆光刺激的“渴求度”。固定比率1:1，即每按一次活跃杆获得1次颅内光刺激；固定比率1:2，即每按两次活跃杆获得1次颅内光刺激；固定比率1:4，即每按四次活跃杆获得1次颅内光刺激。分别以不同顺序(1：11:21:4；1：41:21:1)进行实验，每个比率10min，合计30min，选取每个频率的后5min活跃杆按杆次数代表该固定比率的作用。

多通道光电极记录：

利用螺杆转动推进螺帽向前移动的机械驱动原理，自行设计适合小鼠在体记录的可驱动基座，光电极由一根光纤和四个四通道微电极(tetrode)组成，每个tetrode由四根电极丝紧密环绕、胶水粘接而成，光纤尖端与tetrode的距离为0.3-0.5mm，用胶水将光电极与可驱动基座粘合一起。带有ChR2的病毒载体在光电极埋入术前两周注射于DP，两周后手术埋入光电极，术后恢复一周，开始多通道光电极记录实验。动物行为同步视频录像。局部场电位(LFP)采样频率2kHz，滤波频率1-500Hz；细胞外放电(spikes)采样频率32kHz，滤波频率250-8000Hz。术后一周，开始通过光电极采集神经元放电信号，如果未能成功记录到神经元放电，则每天以50-80µm向DP腹侧推进光电极，直到至少有一个神经元放电信号被采集到。记录到稳定放电信号后，进行激光刺激，采集参数与之前用于行为学实验的一致。

基准线期间(day1-day2)：

此期间，激光发生器处于关闭状态，小鼠按杆无颅内激光刺激。对照组与实验组间小鼠按杆次数无显著差别。

获得期(day3-day7)：

激光发生器开启，小鼠每按一次活跃按杆可获得一次颅内激光刺激，进而激活相应脑区光敏感蛋白ChR2，引起阳离子内流，使神经元去极化，兴奋该脑区神经元。若某一脑区神经元激活具有奖赏效应，则小鼠会不停按杆，获得激光刺激，兴奋相应神经元，随着训练次数增加其按杆次数逐步增加，一定时间内按杆次数的多少代表该脑区奖赏作用的强弱，以对照组按杆均数±3倍标准差为界，如果某一脑区在获得期5天中至少有3天超过此标准则认为该激活脑区具有奖赏作用。对照组小鼠按杆次数与其基准线期间比较无显著差别。

戒断期(day8—day10)：

激光重新关闭，按活跃按杆不再获得颅内激光刺激，若小鼠在获得期按杆确实是为了获得激光刺激而不是因为其他非特异性地原因，则在戒断期小鼠的按杆次数会显著减少。对照组及VO/LO组和cg1/M2组因为在获得期其按杆次未显著增加，故未进行戒断期及后续的重新获得期实验。DP组、PrL组和MO组，与其自身在获得期最后一天(day7)比较，其按杆次数迅速并逐步显著减少。

重新获得期(day11-day14)：

激光重新开启，按下活跃按杆获得颅内激光刺激，但按杆上方指示灯不再亮，以排除指示灯灯光对小鼠按杆行为可能的影响。激光重新引入的第一天，即day11，DP组、PrL组，MO组，DTT组和VTT组，按杆迅速恢复至获得期最高水平，并在随后的几天训练中保持基本一致。

Fig1 兴奋内侧前额叶皮质及周围脑区对自身按杆行为的影响

纵坐标为30min实验小鼠按杆次数，横坐标为训练天数，1-2为基准期，3-7为获得期，8-10为戒断期，11-14为重新获得期，浅蓝色阴影代表这阶段实验按杆可获得激光刺激；实验共8组，分别为DP组、dPrL组、MO组、DTT组、VTT组、Ctrl组、VO/LO组、cg1/M2组；按杆次数超过对照组均数加3倍标准差(Ctrl+3sd)则认为具有奖赏作用。

往期推荐

文献引用：

1.Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Bruegmann Tobias;Malan Daniela;Hesse Michael;Beiert Thomas;Fuegemann Christopher J;Fleischmann Bernd K;Sasse Philipp.Nature methods.2010

2.Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Arrenberg Aristides B;Del Bene Filippo;Baier Herwig.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2009

3.Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Yazawa, Masayuki;Sadaghiani, Amir M;Hsueh, Brian;Dolmetsch, Ricardo E.Nature Biotechnology.2009

4.Neurobiology of autism and attention deficit hyperactivity disorder by means of neuroimaging techniques:convergences and divergences. Proal E;Gonzalez-Olvera J;Blancas A S,et al.Rev Neurol.2013

5.High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. BY Chow;X Han;AS Dobry;X Qian;AS Chuong;M Li;MA Henninger;GM Belfort;Y Lin;PE Monahan;ES Boyden.Nature.2010

6.杨晨. 利用光遗传学解析小鼠内侧前额叶皮质相关奖赏环路[D].第四军医大学,2016.

7.Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Ayling Oliver G S;Harrison Thomas C;Boyd Jamie D;Goroshkov Alexander;Murphy Timothy H.Nature methods.2009

8.The roles of reward,default,and executive control networks in set-shifting impairments in schizophrenia. Waltz J A;Kasanova Z;Ross T J,et al.PLoS One.2013

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