造“鱼钩”

蛋白，其英文单词protein源于希腊文，是“头等重要”的意思。曾经，我们也把蛋白质，翻译成“朊”——元，也是第一的意思。

诚然，蛋白是纷繁生命活动中重要的物质基础。

蛋白千姿百态，通常直径只有几十纳米大小，想要 “抓住”它们中的其中一种，有点像在大海里去抓住一种特定的鱼。其中，有一类“鱼”，被生物化学实验室重点盯着，它们就是阅读器蛋白。

为什么这种“鱼”重要？又为什么比较难捕获？如何打造高效的“鱼钩”？今天，让我们一起随着一项研究来一探究竟。

北京时间7月30日，西湖大学吴明轩团队在Nature Chemistry刊发文章“Single-electron transfer between sulfonium and tryptophan enables site-selective photo crosslinking of methyllysine reader proteins”《基于硫鎓与色氨酸之间的单电子转移实现甲基化赖氨酸阅读器蛋白的位点特异性光交联》。

他们开发了一种全新的蛋白选择性交联策略，并由此开拓了“捕获”赖氨酸甲基化阅读器的新方法。

吴明轩在实验室

蛋白修饰：

从编码到解码  |    TITLE

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什么是赖氨酸甲基化阅读器？我们来逐步解释这个概念。

氨基酸作为构成蛋白的基本单位，可以说是一切生命之源。在化学结构上，氨基酸是一类含有碱性氨基和酸性羧基的两性有机化合物。不同的氨基酸连接在一起，最终通过折叠，形成各种具备3D结构的蛋白质。有趣的是，生命法则虽然复杂，但生物体内的天然氨基酸种类只有20种。

不过，事情没有这么简单。

在酶的催化下，氨基酸可以被“修饰”上化学基团，从而进一步调控生命活动。氨基酸可以被甲基化、乙酰化、磷酸化等等。这些修饰可以通过在氨基酸残基上添加功能基团，影响蛋白质的结构、功能和相互作用，最终调控细胞的信号传导、代谢调节、基因表达等等生物功能。

蛋白质修饰常常被比喻为生命活动的种种“开关”。你可以想象，一个人体内每个细胞的遗传密码基本上是一样的，但为什么会变化出千姿百态的各种细胞？这背后主要就是细胞核里的组蛋白修饰在发挥重要的调控作用。

错误的蛋白质修饰会影响细胞正常的生理功能，进而可能导致癌症等人类疾病。因此，如果我们能够了解这个过程，就可以帮助疾病的治疗。人类第一个分子靶向抗癌药物格列卫，就是通过针对性地抑制激酶介导的蛋白磷酸化，达到治疗目的。

其中，赖氨酸是天然氨基酸的一种，赖氨酸的甲基化修饰十分重要，可以参与调控很多方面，包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用、蛋白质稳定性、亚细胞定位或酶活性。

赖氨酸甲基化过程，以及阅读器识别示意图

如果说蛋白修饰是一种生命编码，那阅读器就是解码器。蛋白甲基化修饰，想要发挥作用，就需要细胞里的阅读器（reader）来配合完成。阅读器会特定地结合到蛋白的化学修饰上，然后再启动下游的信号传导。当然，阅读器本身也是一种蛋白。如果是绕口令的话，可以这样表述——

身为蛋白的阅读器，能读取蛋白上的特定修饰。

吴明轩实验室致力于利用化学方法，为研究和调控蛋白质修饰找到“道路和方法”。而这次，吴明轩实验室所锁定的，就是专门识别赖氨酸甲基化的阅读器。想要研究赖氨酸甲基化阅读器这条“特殊的鱼”，先需要打磨利器——科学家打造的化学探针。

吴明轩实验室一角，有点像摩天轮

钓住那条“鱼”  |    TITLE

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阅读器会找到特定的修饰与之结合，那如果逆向思维，我们“模拟”出修饰，阅读器还是会“乖乖地”跑过来与之结合，这就是开发化学探针的基本思路。

在这些探针中，有一种是共价探针，它通过共价键和蛋白结合，因此这种结合更加牢固，该方法被称为共价交联策略。在天然状态下，阅读器和甲基化修饰结合，并不是通过共价交联，自然状态下的结合“灵活而松散”。但是，在实验室里，共价交联的优势就体现出来了，这种结合方式足够牢固，方便后续通过其他手段鉴定出蛋白。

目前领域内主要使用双吖丙啶为代表的光交联基团，它们在紫外光的激发下形成的活性中间体“大力出奇迹”，会和各种蛋白交联。所以，该类光交联基团需要在阅读器蛋白所结合的甲基化赖氨酸位点附近被引入来实现特定的交联。

这种设计下，“鱼钩”和“鱼饵”被置于“鱼线”上的不同位置，所以二者的相对位置就显得尤为重要，只有鱼钩和鱼饵的距离足够合适，想要的鱼才能够上钩。稍有不慎，“鱼钩”很容易钓到各种不想要的“鱼”，对实验造成干扰。

那么，该如何开发一个全新的“鱼钩”？吴明轩团队的思路，就是让“鱼钩”和“鱼饵”成为一个整体。

基于此设想，团队成员开始研究想要钓取的“鱼嘴”结构——在赖氨酸甲基化阅读器里，其结合口袋为若干个芳香残基形成的芳香笼。通俗地讲，芳香笼可以“识别”到赖氨酸的甲基化，并与之结合。芳香笼形成一个富电子的“口袋”，可以说是阅读器结合甲基化赖氨酸的“核心部件”。

灰色部分就是阅读器蛋白，我们可以把它比做“鱼”，它和甲基化修饰结合的空间，称之为口袋，也可以理解成“鱼嘴”。图中，三个绿色基团是组成芳香笼的芳香残基，黄色是含有甲基化赖氨酸的多肽。

通过对鱼嘴结构的分析，吴明轩团队用硫原子替换氮原子，设计了二甲基硫鎓的活性基团作为“鱼钩”。这个全新的“鱼钩”，一方面自带“诱饵”的能力，能找到“鱼嘴”，另一方面还能与“鱼嘴”中的芳香残基色氨酸发生共价交联，从而牢牢地与之结合。

实验早期迎来了初步进展，团队成员发现探针可以找到阅读器蛋白的“口袋”并与之结合，然而，在推进共价交联的实验过程中他们却经历了一段漫长的困顿期。虽然在理论上硫鎓基团与色氨酸有潜在交联活性，但他们在进行了大半年的实验后，仍旧无法实现该共价交联反应。

转机出现在实验条件的调整上。实验团队发现，在紫外光激发下，二甲基硫鎓能够选择性地与口袋内色氨酸上富电子的吲哚基团共价交联。

“关键的时刻，被光推了一把。”吴明轩说。

紫外光激发下，单电子转移的反应策略

按照实验的流程，实验团队先是在重组蛋白上验证了硫鎓探针对阅读器蛋白交联具有普适性。然后，团队成员进一步将硫鎓探针应用到细胞核样品，通过蛋白质组学鉴定到大部分已知的阅读器蛋白，同时还找到了此前未知的阅读器蛋白。

面对这种新发现的阅读器蛋白，实验室通过质谱技术进一步锁定口袋内发生交联的色氨酸，以便进一步了解新阅读器的功能。基于硫鎓探针具有位点特异性交联的特性，吴明轩实验室联合中国科学院大连化学物理研究所张丽华团队开发了交联质谱鉴定方法——该方法不仅能够检测到交联的蛋白，还能确定口袋内交联的关键色氨酸。

在细胞核提取物中“钓取”阅读器蛋白示意图

吴明轩实验室开发的基于二甲基硫鎓的共价探针，实现了基于阅读器蛋白结合活性的位点选择性交联，相比领域传统方法有若干优势——

首先，由于硫鎓可直接模拟甲基化赖氨酸，因此无需优化其引入位点，所以合成相对简便。其次，硫鎓基团只与芳香笼 “口袋”内具有相互邻近作用的色氨酸发生交联，极大地降低了非特异性交联带来的问题。

吴明轩表示，新的“鱼钩”将会为赖氨酸甲基化研究提供新的工具，同时在该项研究中所开发的新的反应策略——硫鎓介导的色氨酸选择性光交联——也拥有广阔的应用前景，特别是同样拥有芳香笼的蛋白，例如胆碱和甜菜碱结合蛋白的相关研究。