药物与蛋白结合验证及关键结合氨基酸位点解析方法：基于MST微量热泳动技术

MST(MicroScale Thermophoresis)微量热泳动可以定量分析分子间相互作用。实验时对互作分子中的一个分子进行荧光标记，使之成为非常灵敏的标签分子，在 MST 技术中称之为 Target;与之互作的另一个分子称之为 Ligand。Target 分子与 Ligand 分子结合形成复合物，复合物分子的尺寸、水化层和电荷的改变都可以导致复合物分子的热泳动速度相对于 Target 分子热泳动速度发生改变，因此很容易检测到到由 Target 与 Ligand 分子的结合引起的 MST 信号变化。进行 MST 实验时将 Ligand 分子按照2倍的浓度梯度稀释配制16管溶液，然后和 Target 分子等体积混合，吸入毛细管后放入仪器中进行检测。检测时仪中的红外激光束对毛细管的的检测区域正中心进行加热，激光束周围的溶液形成温度梯度，分子在温度梯度溶液中由高温区域向低温区域定向移动，并且移动速度和分子的尺寸大小、水化层及电荷有关。激发光激发 Target 分子上的荧光基团，通过检测 Target 分子荧光基团发出的发射光的荧光强度变化，从而记录了热泳动速度的差异。下面左图中每一条曲线是一根毛细管中的荧光强度实时记录曲线，记录了荧光强度在温度梯度中随时间的变化。然后将荧光强度的数值做纵坐标，配体浓度做横坐标进行拟合作图，软件自动计算得到该结合的亲和常数 KD 值。

图1 MST 技术原理

案例一

MST在肠抑脂素与新受体

互作研究中的作用

2024年3月28日，清华大学生命科学学院的王一国副教授团队与南方医科大学的张惠杰团队在 Cell 上在线发表了题为“A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism”的研究论文，首次发现并命名了一种新的肠道激素 Cholesin (肠抑脂素)，揭示了 Cholesin 在机体胆固醇的稳态平衡中的调控和作用机制。

由于肠道是外源胆固醇吸收的主要场所，为研究肠道胆固醇吸收与肝脏胆固醇合成之间的关系，研究者通过高胆固醇喂食用小鼠发现了小鼠中的人蛋白 C7orf50 同源物 Cholesin 的表达显著增强，并在后续的小鼠基因敲除实验中确定了 Cholesin 可调节人血浆中胆固醇水平。为寻找 Cholesin 参与调控机体胆固醇的调控机制，研究者通过 GST-Cholesin 与小鼠不同组织的冷冻切片的结合实验和流式细胞术评估不同细胞系对 Cholesin 的结合能力，从而确定 MCF7 细胞是 Cholesin 的高亲和力结合细胞（图2A）。随后通过 MCF7 细胞的 CRISPER 筛选确定 Cholesin 的可能配体是 GPR146，并在 GPR146 KO 小鼠组织冷冻切片的免疫荧光染色确定了 GPR146 KO 的小鼠组织和肝细胞无法结合 Cholesin，进一步确定了 GPR146 与 Cholesin 的结合（图2B）。

图2 GPR146 是 Cholesin 的受体

为证实 GPR146 与 Cholesin 的直接互作以及二者的亲和力，研究者通过微量热泳动技术（MST）定量测定了 Chelesin 与 GPR146 的亲和力，并测得平衡解离常数高达21.34±0.98 nM。同时，为确认 Chelesin 与 GPR146 互作的关键氨基酸，研究者利用 Alphafold 预测了 GPR146 的结构，并基于序列和结构分析对 GPR146 做出多点突变，通过 MST 定量测定了 Chelesin 与 GPR146 mutant 的平衡解离常数较 wild type GPR146 显著下降，达到971.0±91.5 nM，从而确定了 GPR146 与 Chelesin 互作的关键氨基酸（图3）。

图3 MST 检测 Chelesin 与 GPR146 的平衡解离常数

Microscale thermophoresis assay (MST)

The microscale thermophoresis (MST) assay was performed as previously described.72,73The affinity of the purified ligands for receptors was measured using the Monolith NT.115 from NanoTemper Technologies. Receptors were fluorescently labelled according to the manufacturer’s protocol and about 50 nM of labelled protein was used for each assay. To create a suitable concentration gradient, a solution of unlabeled ligands was diluted accordingly. After a 30-minute incubation at room temperature, the samples were loaded into NanoTemper glass capillaries. Measurements were performed using 20%-100% LED power and High MST power settings. For each affinity measurement, the assays were repeated three times to ensure accuracy and reproducibility. The Kd values were calculated using the mass action equation with the assistance of the NanoTemper Analysis software. For analysis, the change in thermophoresis is expressed as the change in the normalized fluorescence (DFnorm), which is defined as Fhot/Fcold.

案例二

MST在小分子及其

互作配体蛋白研究中的作用

2022年2月1日，上海中医药大学的屈祎团队在《Cell Reports》在线发表了题为“Liquidambaric acid inhibits Wnt/b-catenin signaling and colon cancer via targeting TNF receptor-associated factor 2”的研究论文。该研究报道了一种新型小分子 LDA，通过靶向 TRAF2 蛋白抑制 Wnt/β-catenin 信号通路，揭示了 TRAF2 作为结肠癌治疗新靶标的潜力，为结肠癌的治疗提供了新的思路。

研究者通过对天然产物库的筛选确定 LDA  (Liguidambaric acid)可抑制 Wnt/β-catenin 通路，并通过 CRISPR 敲除 TRAF2 基因确定了 TRAF2 的缺失削弱了 LDA 对 Wnt 通路的抑制效果，揭示了 TRAF2 可能是 LDA 的直接靶蛋白。为确认 LDA 和 TRAF2 是否直接结合，研究者采用了微量热泳动实验（MST）测得 LDA 与 TRAF2 的平衡解离常数 Kd=6.02 μM，而作为 LDA 类似物的 OA 却不能结合 TRAF2，表明了 LDA 可直接结合 TRAF2 蛋白（图4A，B）。

图4 MST 测定 LDA 直接结合 TRAF2 蛋白

为进一步确定 LDA 与 TRAF2 蛋白相互作用的具体位点，研究者构建了 TRAF2 的多个突变体，包括 TRAF2TC、TRAF2 ΔTC 和 TRAF2TC（Δ408-431）。通过微量热泳动实验（MST）测定 LDA 与这些突变体的亲和力，结果证实 LDA 结合于 TRAF2TC 结构域（图5）。

图5 MST 检测确定 LDA 结合 TRAF2 TC

为明确 TRAF2 在 LDA 抑制 Wnt/β-catenin 信号通路中的作用，研究者通过关键组分的共免疫沉淀（Co-IP）实验观察到，β-catenin 能在 TRAF2 的免疫沉淀中被轻松检测到。为进一步验证 TRAF2 与 β-catenin 之间的结合，研究者利用微量热泳动（MST）技术测定了 GFP-TRAF2 过表达的 293T 细胞裂解液与 β-catenin 的亲和力，结果表明其平衡解离常数为8.41 μM（图6A）。此外，在存在 LDA 的情况下，MST 检测显示 GFP-TRAF2 失去了与 β-catenin 的结合能力（图6B），这表明 LDA 与 TRAF2 的结合破坏了 TRAF2 与 β-catenin 之间的相互作用。为探究 β-catenin 与 TRAF2 的关键结合位点，研究者进一步通过 MST 测定了 GFP-TRAF2 与各 β-catenin 突变体之间的亲和力，结果证实 TRAF2 主要与 β-catenin 的 N 端1-32区段结合。

图6 MST 测定 TRAF2 与 β-catenin 的结合

在这项研究中，研究者多次采用微量热泳动（MST）技术，系统地测定了蛋白与蛋白、蛋白与小分子之间的相互作用。这一方法使得 LDA 与 TRAF2 结合的关键序列得以明确，同时也定位了 TRAF2 结合 β-catenin 的关键区段。研究通过 MST 这一关键技术，深入探讨了 TRAF2 在 Wnt/β-catenin 信号通路中的核心作用，进一步揭示了 TRAF2 作为结肠癌治疗潜在靶点的可能性，也为未来结肠癌的靶向治疗提供了新的思路和策略。

Microscale thermophoresis assay (MST)

The MST binding assay using NanoTemper monolith NT.115 was described previously (Qu et al., 2016, 2018). When purified protein was used as target, protein was labeled with Monolith Series Protein Labeling Kit (MO-L011, NanoTemper Technologies). When cellular protein was used for target protein, HEK293T cell was overexpressed with GFP-tagged protein of interest for 24 hours before preparation of cells lysates. The sample was loaded into the glass capillaries (MO-K022, NanoTemper Technologies), and the MST measurements were performed at 25℃, 80% LED power and 10% IR-laser power. Kd values were calculated using the mass action equation available in NanoTemper software

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