Cell丨汪桦等通过免疫加感染策略在恒河猴中诱导出强效广谱抗HIV中和反应

自上世纪80年代被发现以来，人类免疫缺陷病毒已累计造成全球约4230万人死亡。目前，全球范围内的HIV感染人数约为3990万，年度新增感染人数约为130万，年度死亡人数约为63万。因此，HIV感染是全球严重的公共健康问题之一。由于疫苗已被证明是控制传染性病原体的有效手段，例如灭绝天花病毒，控制脊髓灰质炎病毒和2019 新型冠状病毒等，因此研发出一种安全高效的HIV疫苗是控制HIV传播的最佳手段之一。

由于HIV自身具有的一些特点，例如在感染早期建立病毒储藏库，基因组具有高度突变性和多样性，病毒表面包膜糖蛋白（Env）具有高度糖基化和易于形成构象遮蔽，以及中和抗体的诱发机制不明确等，所以HIV疫苗的研发异常艰难，已经过近40年研发，至今仍无安全有效的HIV疫苗上市。

近年来，美国国立卫生院疫苗研究中心的John R. Mascola实验室和Peter D. Kwong实验室从一名HIV感染者体内首次分离出一种主要结合HIV Env上保守的融合肽区域的广谱中和抗体 VRC34.01抗体。接着，该研究团队以FP为靶标，设计出一种全新的表位疫苗免疫策略（FP初次免疫和重组Env三聚体蛋白加强免疫），并成功在小鼠、豚鼠和恒河猴等多种动物模型中诱导出针对FP区域的HIV广谱中和抗体。研究团队一系列的研究成果令人振奋，使针对FP的表位疫苗免疫策略成为当今HIV疫苗研究领域的热点和重点之一。然而，目前在模型动物体内诱导出的中和反应在血清/血浆中的中和滴度并不高，可能难以高效阻断HIV感染并提供长期保护。

2024年10月28日，VRC/NIH的Peter D. Kwong 实验室和John R. Mascola实验室联合（第一作者为汪桦）在Cell上发表了题为Potent and broad HIV-1 neutralization in fusion peptide-primed SHIV-infected macaques的文章。该研究利用猴-人嵌合免疫缺陷病毒 (Simian-human immunodeficiency virus, SHIV）感染已经过FP初次免疫和Env三聚体蛋白加强免疫的恒河猴，旨在模拟HIV自然感染，对FP和Env免疫诱导的并可以产生中和抗体的记忆性B淋巴细胞（Memory B cells）进行饱和刺激，探索疫苗诱导的记忆性B淋巴细胞是否有能力在机体内产生足够数量和高质量的抗HIV广谱中和抗体，以达到有效疫苗所需的高血清滴度的广谱抗HIV中和活性，为有效HIV疫苗的研发提供指导。

首先，研究者对10只恒河猴进行6次FP初次免疫，并利用两种Env trimer (BG505 and ConC) 进行6次加强免疫。通过血浆FP竞争中和实验，研究者证明在其中4只恒河猴中诱导出了明显的针对FP区域的中和抗体，其体内具有疫苗诱导产生的针对FP的记忆性B淋巴细胞。接着，研究者对这10只恒河猴进行SHIV接种。感染仅8周后，在19株HIV-1假病毒组中有FP中和反应的4只恒河猴的血浆中和活性大幅提升。为了更好的检测血浆中和强度和广谱度，研究者选取每只恒河猴在SHIV感染后的中和活性峰值点血浆，在包含多种亚型的208株HIV-1假病毒组中进行全面系统的中和活性鉴定。结果显示，具有之前疫苗诱导产生的针对FP中和反应的4只恒河猴，其血浆中和广谱度（在208株检测假病毒组中可达45%至77%，并且几何平均血浆中和滴度约为100；而对之前疫苗免疫未有高效应答的6只恒河猴，其血浆中和广谱度仅为4%至29%。然后，研究者对血浆中和数据进行中和指纹辨识分析，结果显示SHIV感染后大幅提升的血浆中和活性极有可能是针对FP区域的。此外，在SHIV感染后的多个时间点，研究者对恒河猴血浆中的SHIV病毒RNA进行单基因测序，发现在感染后16周时，有6只恒河猴（包括全部4只产生强效广谱中和反应的恒河猴）体内的病毒RNA在Env的FP区域出现明显的逃逸突变，说明体内针对FP区域的广谱中和抗体对SHIV病毒造成了强大的免疫筛选压力。

其次，研究者通过单个B淋巴细胞分选和抗体克隆技术，利用FP和Env trimer作为钓饵蛋白从全部4只高反应恒河猴的中和峰值时间点的外周血淋巴细胞中，分离针对FP和其他表位的单克隆抗体。研究者从每只恒河猴中分离到约77至103个单克隆抗体，根据其基因序列相似度可划分为约8至24个抗体系，其中大部分是针对FP区域的中和抗体。通过在19株HIV-1假病毒组的中和活性检测，研究者在这4只恒河猴中共发现16个具有跨亚型交叉中和反应活性的抗体系。研究团队选取其中6个抗体系中的代表单克隆抗体，在包含多种亚型的208株HIV-1假病毒组中进行全面中和活性鉴定，结果显示中和广谱度（50%抑制浓度小于50μg/mL; IC50<50μg/mL）为34%至58%，其中一个强效抗体TRNM-b.01的几何平均抑制浓度高达0.43μg/mL，与从HIV-1自然感染者中分离的VRC34.01抗体相当。接着，研究者通过对血浆中和活性和对应分离的单克隆抗体中和活性进行相关性分析，利用数学模型推测在每只恒河猴血浆内的不同单克隆抗体的浓度，并且按照推测数据利用每只恒河猴中分离的多种单克隆抗体来制作模拟“血浆”。通过对模拟“血浆”的中和活性检测，研究者发现其与真实血浆中和数据高度相关，相关系数为0.72至0.99，证明血浆中的强效广谱中和反应主要是由分离的广谱中和抗体引起的。

再次，研究团队在SHIV感染前后的多个时间点，进行抗原特异性单个B淋巴细胞抗体基因测序，对以上16个具有交叉中和反应活性的抗体系进行追踪和抗体亲和成熟路径分析。结果显示，绝大多数具有交叉中和反应活性的抗体系起源于SHIV感染之前，是由FP和Env trimer免疫诱导引发的。并且，相较SHIV感染前，这些抗体系基因的体细胞突变频率在SHIV感染后明显提升。SHIV感染后，其中两只恒河猴的广谱中和抗体系进行了高度扩增，并显示出巨大差异，其在同一抗体系内的可变区氨基酸序列差异高达25%和30%。此外，通过抗体纵向系统发育分析，研究者发现同一恒河猴内的多个具有交叉中和反应活性的抗体系可能起源于早期同一抗体系。因此，在每只具有高中和反应的恒河猴中，很可能仅有1-2个由疫苗引发的针对FP区域的广谱中和抗体系引发了血浆中的强效广谱抗HIV反应。

最后，研究团队从16个具有交叉中和反应活性的抗体系中挑选各自的代表抗体，解析其与HIV-1 Env trimer复合物的冷冻电镜结构，来进一步研究这些抗体的精确结合表位、作用方式和中和机制。研究者共得到13个抗体与Env trimer复合物的高分辨率冷冻电镜结构，并发现其中10个抗体主要结合FP区域的氨基端，2个抗体主要结合FP邻近区域的N88糖基化位点，1个抗体主要结合CD4结合位点。令人振奋的是，FP区域的氨基端和邻近区域的N88糖基化位点均为此疫苗设计模板抗体VRC34.01的主要结合位点。研究者通过对这些冷冻电镜结构的分析和对比，发现在3只恒河猴体内针对FP区域的抗体系与之前团队报道的DFPH-a抗体系属于同一抗体家族，证明诱导这一针对FP区域的广谱中和抗体系并非偶发，可在多个实验动物体内重现。

综上所述，本研究采用了一种非常规的手段（SHIV 感染）对记忆性B淋巴细胞进行饱和刺激，并在血清/血浆水平得到强效广谱抗HIV中和反应。虽然难以直接将SHIV感染加入疫苗免疫策略，但是通过此方法证明了HIV免疫原诱导的记忆性B淋巴细胞有能力提供足够数量或高质量的广谱中和抗体，进而在血清/血浆水平上提供有效HIV疫苗所需的强效广谱抗HIV中和反应，进一步验证了针对FP区域的HIV表位疫苗设计策略。下一步，研究团队将着重研究SHIV感染在体内诱发强效广谱抗HIV中和反应的详细机制，并希望在疫苗免疫策略中通过调整免疫佐剂、接种方式和采用复制型蛋白表达病毒载体等来“模拟”SHIV 感染，推动HIV疫苗的研发。

本研究的通讯作者为Peter D. Kwong，第一作者为汪桦。此外，在本研究中做出重要贡献的还有VRC/NIH的Cheng Cheng, James L. Dal Santo, Chen-Hsiang Shen, Tatsiana Bylund, Amy R. Henry, Colin A. Howe, Juyun Hwang, Sergei Pletnev 和 Tongqing Zhou；宾夕法尼亚大学George M. Shaw 实验室的Daniel J. Morris；哥伦比亚大学Lawrence Shapiro 实验室的Nicholas C. Morano和Ryan S. Roark。

文章转载自BioArt