从NC文章学习蛋白质组学数据处理！

   这篇NC文章详细比较了不同的蛋白质组学下机数据处理的WorkFlow，比较了其中每个环节可能带来的影响。对于要分析蛋白质组下机数据有很好的参考意义。比如说，缺失值要怎么处理，使用什么样的策略插补数据更准确？

下面，来学习下这篇文章。

在蛋白质组学工作流程中，差异表达蛋白的鉴定通常包括五个关键步骤：

原始数据定量、

表达矩阵构建、

矩阵归一化、

缺失值插补（MVI）

差异表达分析。

研究者整合了12个无标记DDA数据集、5个TMT数据集和7个无标记DIA数据集，构成目前最全面的基准数据集集合。这些数据集用于测试和优化DEA工作流程。

随后，构建了不同的WorkFlow：

1. DDA数据定量

FragPipe v20.0

：采用默认定量参数，使用MSFragger-3.825进行数据库搜索，并通过Philosopher v5.0.0添加污染物和反向序列。定量平台包括Top0（所有前体）、Top3（仅考虑前3个最强的前体）和MaxLFQ（最少2个离子的计算）。

MaxQuant v2.1.0.0

：作为替代定量平台，使用Andromeda进行数据库搜索，Top0、Top3和MaxLFQ定量，采用与FragPipe相同的参考库。

2. DIA数据定量

DIA-NN v1.8.1

使用默认参数进行定量，数据库通过预测库进行匹配，提取Top1（最强的前体）、Top3和MaxLFQ强度。

Spectronaut 18

作为替代平台，使用与DIA-NN相同的数据库和库预测，定量方法与DIA-NN类似。

3. TMT数据定量

FragPipe v20.0

MSBooster、Percolator和ProteinProphet用于肽段鉴定和蛋白质推断，定量使用TMT-Integrator和Philosopher。提取TMT-Integrator的丰度（abd）和比率（ratio），以及Philosopher的强度。

MaxQuant v2.4.4.0：

使用Reporter ion MS2的10plex TMT进行定量，提取报告离子的强度。

4. 表达矩阵类型、归一化、插补和DEA统计工具

表达矩阵类型：

对于LFQ-DDA数据（FragPipe和Maxquant），有光谱计数、Top0、Top3、MaxLFQ和directLFQ等类型。

对于DIA数据（DIA-NN和Spectronaut），有Top1、Top3、MaxLFQ和directLFQ。

对于TMT数据（FragPipe和Maxquant），有TMT-Integrator的丰度、比率、Philosopher强度等。

归一化和插补：

使用常见的归一化方法（如对数归一化、标准化）和插补方法（如基于KNN或其他插补算法）来处理缺失数据。

不同工作流之间存在显著的性能差距

表达矩阵类型、归一化方法、插补方法、差异分析方法对分析性能的影响

表达矩阵类型：dlfq在label-free设置中表现最佳，LFQ次之，TMT设置下TMT-Integrator abundance优于其他类型。

标准化方法：无标准化选项表现良好，尤其在使用内置标准化的定量方法（如dlfq、LFQ）时。需要标准化时，推荐 “lossf” 和 “center.median”。

缺失值插补（MVI）算法：MinProb表现最好，尤其在多个设置中，missForest在FG_DDA和MQ_DDA表现好，但时间消耗大。

DEA统计工具：limma、ROTS、DEP和proDA排名靠前，但proDA运行较慢。plgem在基于计数的DEA中表现最佳。

集成推断的方法整合不同高性能DEA流程可以有效提升差异表达蛋白的检测性能

最后，总结不同的WorkFlow推荐使用的数据处理方法：

1. 针对特定定量设置的推荐工作流程：

LFQ-DDA数据（FG_DDA）：

使用FragPipe定量，推荐结合以下步骤：

数据处理：

使用directLFQ强度

数据归一化：

不做额外归一化

缺失值插补（MVI）：

SeqKNN

差异表达分析（DEA）：

DEqMS或ROTS（若关注运行时间，可用limma替代）

LFQ-DDA数据（MQ_DDA）：

使用MaxQuant定量，推荐工作流程类似FG_DDA，唯一差异为使用Impseq进行MVI。

LFQ-DIA数据（DIANN_DIA）：

使用DIA-NN定量，推荐结合以下步骤：

MVI：

MinDet

DEA：

limma或ROTS

LFQ-DIA数据（spt_DIA）：

使用Spectronaut定量，推荐使用Impseq作为MVI方法，ROTS作为DEA方法。

TMT数据（FG_TMT）：

使用FragPipe定量，推荐结合SeqKNN和limma，数据处理采用TMT-Integrator丰度值。

TMT数据（MQ_TMT）：

使用MaxQuant定量，推荐结合bpca（MVI方法）和proDA（或limma）。

无平台或定量信息的表达矩阵：

推荐使用一系列灵活的选项，如SeqKNN、MinDet或Impseq作为MVI方法，limma或ROTS作为DEA方法。

2. 实验设计建议：

推荐LFQ-DIA和TMT作为蛋白质组学实验设计的优选方法。DIA和TMT具有更高的蛋白质覆盖率和更低的缺失率。

若需直接选择DIA或TMT，需根据实验需求（如复用水平、动态范围、预算）做决策。(PS：毕竟DIA便宜，有钱可以做TMT)