动物行为与光电专题（47）丨光解笼在动物癫痫样行为中应用

《动物模型构建与行为学评估》电子版pdf，网盘发货

《动物模型构建与行为学评估》V1.0共计约540页，主要围绕生物医学领域中动物实验的核心方法，详细介绍了如何通过构建动物模型来研究疾病机理，并且使用行为学评估手段验证这些模型的有效性。书中的内容适用于研究人员在进行神经科学、药理学、生物医学等领域的实验时，理解和运用动物模型这一重要工具。

实验动物均用腹腔注射10mg/kg剂量KA溶液诱发痫样发作模型。分为海马CA1注射Rubi-GABA+光纤光刺激组和海马CA1注射生理盐水+光纤光刺激组。初级运动皮层M1均注射Cal-520AM，植入光纤记录信号。

光解笼Rubi-GABA所用的光路示意图如图所示。激光器的出射光波长为458nm，可以通过软件调节其功率和开关。出射光经过6倍扩束镜后进入4倍物镜聚焦，通过光纤用于急性痫样发作模型小鼠的光刺激，解笼RubiGABA。用于光解笼Rubi-GABA的光纤端面功率保持在15mW左右。

Fig1 光解Rubi-GABA的光路示意图

实验方法

KA全身给药诱发急性痫样发作后，在观察到初级运动皮层M1出现痫样钙波时，用软件控制光解笼所需激发光开启，每次光照时间为30s，每只实验鼠共进行十次光照。实验过程中使用录屏软件Bandicam同时录制钙信号记录窗口、行为学记录窗口和控制光解笼软件界面。

海马CA1局部光解笼Rubi-GABA对M1痫样钙信号的影响

腹腔注射10mg/kg剂量的KA溶液可以成功建立小鼠急性痫样发作模型。由于KA全身给药诱发痫样发作模型的发作起始位点广泛认为是在海马，临床上手术治疗癫痫的手段也是切除海马的一部分，所以对海马进行局部控制可能是抑制痫样发作的有效途径。以一只实验小鼠结果为例对实验结果进行描述。  

Fig2 麻醉1.2%、清醒、痫样发作海马CA1光解笼Rubi-GABA时M1的钙信号

在1.2%麻醉和清醒自由活动时，初级运动皮层M1的信号与第一章中双通道记录的结果相似。BCDE分别代表腹腔注射10mg/kg剂量KA溶液诱发急性痫样发作后随时间发展的阶段，即第一、二、三、四五次在海马CA1给光照光解Rubi-GABA时，M1的钙信号的变化。其中蓝色横线代表光照时间，每次光照30s。  

Fig3 中红色方框部分放大

在海马CA1局部光解笼Rubi-GABA对初级运动皮层M1的痫样钙信号产生了一定的影响。两个实验脑区基线抬高类的钙信号出现具有一定的同步性，所以本章实验选择在观察到初级运动皮层M1有基线升高的痫样钙信号出现时，在海马CA1进行光解笼Rubi-GABA。

初级运动皮层M1的痫样钙信号分为两种类型，一种是幅值很大，持续时间很长的CSD样波形，另一种是幅值较小，持续时间较短的非CSD样波形，并且这两种钙信号在不论上升或下降时都较为光滑。说明痫样钙波出现时，M1神经细胞的钙离子荧光是逐渐整体变亮然后逐渐整体变暗的缓慢变化。但本章实验中，在海马CA1光解笼Rubi-GABA时，可以看见初级运动皮层M1的信号出现明显的“变形”。开始光照后，M1的钙信号幅值开始显著上升，并且出现了高频脉冲样的震荡，这是在单纯的记录中没有在M1出现过的。说明这个时候M1的神经细胞的钙离子荧光是在变亮且伴随着不停地闪烁，说明了这个时候神经细胞的活动更加增强。而且值得注意的是，在这三次光照后，在这种非常规的类非CSD波形结束后，都伴随出现一个CSD样的波形。相同给药剂量的情况下，一般初级运动皮层M1中CSD样的波形出现次数在0~2次范围内，多数均只出现1次；而在海马CA1局部光解笼Rubi-GABA时，M1中CSD样波形出现次数在3~4次。这种差异可能也表征着在海马CA1局部光解笼Rubi-GABA会引起初级运动皮层M1区神经细胞群体活动的增强。但这种变化代表的是痫样发作后期会朝着更严重还是减轻的方向发展目前还尚不清楚。在第四次和第五次光照后，虽然也有一点震荡样波形出现，但非CSD样的波形的“变形”就不太明显了，而且光照后也没有出现CSD样的大型钙波，猜测可能是因为在海马CA1区注射的Rubi-GABA的总量有限，前三次共90s的光照已经光解笼了大部分的Rubi-GABA，所以后续的光照对M1的痫样钙信号就没有明显的影响。  

为了排除这种让初级运动皮层M1痫样钙信号“变形”的影响是由较高强度的光照本身引起的的可能性，在海马CA1注射生理盐水，其他条件不变进行光照实验和信号记录。当海马CA1没有Rubi-GABA存在时，仅相同强度和持续时长的光照不会对初级运动皮层M1的痫样信号产生变形影响，光照后也不会出现CSD样的波形。说明非CSD样痫样钙信号“变形”确实是由光解笼Rubi-GABA引起的。

Fig3 对照组海马CA1生理盐水+光照时初级运动皮层M1的钙信号 

海马CA1局部光解笼Rubi-GABA对行为学发作的影响

清醒自由活动状态下，小鼠在记录装置中表现正常，有生理状态下的洗脸、理毛、直立等探索行为。正常活动时，运动基本不会对钙波造成影响，钙活动基线平稳，无明显的大波出现。

腹腔注射10mg/kg剂量的KA溶液诱导急性痫样发作，在初级运动皮层M1观察到有基线上升的钙波出现时，在海马CA1进行光解笼。以下以一只实验动物为例，简述光解笼Rubi-GABA与痫样钙信号和行为学发作之间的关系。

从给药后一直到痫样钙波出现前，实验小鼠一直保持2级发作，即呆滞，耸肩，面部、前肢不自主运动；在钙波开始上升到开始给光照前，实验小鼠行为学发作等级没有明显变化；在开始给光照后，实验小鼠行为学发作等级明显升高，开始出现3~4级发作，即头部，肩部，前肢剧烈抽搐阵挛，身体开始倾斜并伴有跌倒倾向；这种3~4级发作持续到痫样钙波开始下降，在钙波下降阶段刺状脉冲消失后，实验小鼠发作等级恢复到2级，保持半侧躺状态，面部、前肢不自主运动。值得注意的的是，在后接CSD样大型钙波出现，升起到波峰最高点时，实验小鼠从半侧躺状态突然坐起，出现强直现象；随着CSD样钙波下降，由强直状态逐渐放松，最后恢复到1~2级发作，主要表现为呆滞不动，伴有偶尔的头部抽动，这种状态一直保持至图2.3C波形出现。

当光照前的小平台期出现时，实验小鼠从1~2级发作转变为2级发作，即从头部偶尔抽动变为头部颈部快速小幅度阵挛；当小平台期过去，钙波开始再次上升并在海马CA1开始光照时，实验小鼠发作等级明显升高至4级，表现出反复直立跌倒，头部，前肢明显阵挛，光照停止后该表现也没有明显变化，而是和异常高频脉冲样痫样钙波对应，一直持续4级发作；当高频脉冲样波形结束，CSD样钙波出现时，抽搐样发作行为突然停止，实验小鼠突然强直，双侧前肢僵硬前伸，尾部直立；随着CSD样波形下降强直逐渐放松，前肢前伸缓解，尾部下放，恢复到1~2级发作，即呆滞，头部寒颤样颤动。实验小鼠主要保持1~2级发作，有左右侧躺倾向，呆滞，偶尔出现一次性的前半身体战栗现象。  

当刚开始钙波升高时，实验小鼠行为学无明显变化，主要表现为蹲姿，呆滞，点头；当第一个小波下降到一半再次上升时，实验小鼠发作等级增强到3级，即直立，面部不自主运动和前肢持续性高频阵挛；当开始光照以后，实验小鼠发作等级持续加重至4级，即反复直立跌倒，双侧前肢剧烈阵挛；当高频脉冲样波形结束，钙波整体突然开始下降时，实验小鼠阵挛突然停止，出现强直现象并伴随左右侧倒；当后续CSD样大型钙波出现时，上升阶段实验小鼠变为持续侧卧强直，当其降回基线时实验小鼠突然抽动，从强直状态逐渐放松，恢复到1~2级发作，主要表现为侧躺，缓和一会儿后变为蹲姿，之后保持呆滞和偶尔一次性地抽搐，其中偶尔一次性的抽搐并不会有相应钙信号变化。两次钙波出现时，实验小鼠均从1~2级的呆滞，头部、前肢不自主运动的发作状态提升至3级直立，前肢持续性高频阵挛发作。海马CA1光照对初级运动皮层M1的钙信号和行为学发作均无明显影响。到后期实验小鼠的发作相比前期更加严重，3级及以上明显发作的间隔时间变短，从整体的发作状态上看，在海马CA1光解笼Rubi-GABA对实验小鼠行为学发作也没有明显的治疗效果。

当海马CA1没有注射Rubi-GABA仅注射生理盐水时，仅给相同强度和持续时间的光照对初级运动皮层M1的痫样钙信号和实验小鼠的行为学发作均无明显影响。证明这种初级运动皮层M1的痫样钙信号“变形”和实验小鼠行为学发作等级相对变严重的现象确实是由光解笼Rubi-GABA引起的，而不是受光照本身的影响。