羟基抗氧化能力（HORAC）检测试剂盒实验解决方案

原理

羟基抗氧化能力（Hydroxyl Radical Absorbance Capacity, HORAC）是一种检测各种样品中生物分子抗氧化能力的方法，可反映抗氧化剂转移羟自由基的能力。CheKine 羟基抗氧化能力（HORAC）检测试剂盒（荧光法）可检测动物或植物组织、细胞或细菌、血清（浆）等样本，其原理是以荧光素钠为荧光探针，芬顿反应产生羟自由基，根据羟自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化，荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度。在抗氧化剂存在时，它可以抑制由自由基引起的荧光变化。抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力。

自备耗材

·荧光酶标仪（激发波长为485 nm，发射波长为525 nm）

·全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头

·低温离心机、恒温箱、制冰机

·去离子水、PBS (pH 7.4)、丙酮

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

1×Assay Buffer：使用前，Assay Buffer (2×)用去离子水稀释成1×Assay Buffer，充分溶解待用。4℃保存。

1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用1×Assay Buffer稀释成1×ReagentⅠ，充分溶解待用。用不完的ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。不要储存稀释的1×ReagentⅠ溶液。

1×ReagentⅡ：使用前，ReagentⅡ(32×)用去离子水稀释成1×ReagentⅡ，充分溶解待用。4℃避光保存。

注意：ReagentⅡ有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温。用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

Trolox Standard (5 mM)：使用前，用1×Assay Buffer稀释成0.1 mM浓度，充分溶解待用。用不完的Trolox Standard（5 mM）-20℃避光分装保存，避免反复冻融。

Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存1个月。

1. 动物组织：称取0.1 g样本，加入1 mL冷的1×Assay Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

2. 植物组织：称取0.1 g样本，加入1 mL冷的1×Assay Buffer捣碎，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

3. 细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1 mL冷的1×Assay Buffer，冰浴超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

4. 血浆或血清：用1×Assay Buffer稀释10倍或更多进行检测。

5. 液体样本：10,000 g，4℃离心10 min，去除微粒，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。

6. 亲脂性样本：亲脂性样本溶于100%丙酮中，用50%丙酮稀释，在室温下孵育1 h，10,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。在进行测定之前，根据需要稀释上清液。

7. 固体或高蛋白样本：称取固体样本，加入去离子水（1:2，W/V），冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去离子水洗涤，将此洗涤液与水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用1×Assay Buffer稀释并直接用于分析。而不溶物部分加入纯丙酮（1:4, w/v）在室温下混合30-60 min来进一步提取。10,000 g，4℃离心10 min，取丙酮提取物的上清液用50%丙酮稀释。通过将水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的结果相结合，计算出总HORAC值。

注意：该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1501的测定。

实验步骤

1. 荧光酶标仪预热到37℃，调节激发波长为485 nm，发射波长为525 nm。

2. 操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：

3. 混匀，立即用荧光酶标仪读取荧光值，每5 min读取1次，总共60 min。荧光酶标仪的测定条件为激发波长为485 nm，发射波长为525 nm，仪器温度保持在37℃。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。空白孔的最终测定值应小于初始值的10%。

结果计算

HORAC值根据荧光衰减曲线下净面积(Area Under the Curve, AUC)=[AUC待测样(抗氧化剂)-AUC(空白)]计算抗氧化剂的活性。

1. 从下面的等式计算AUC

AUC=1+RFU1/RFU0+RFU2/RFU0+RFU3/RFU0+……+RFU59/RFU0+RFU60/RFU0

RFU0=0 min的相对荧光值。

RFUx=x min的相对荧光值（例如，RFU5是5 min时的相对荧光值）。

2. 计算净AUC：净AUC=AUC(样本)-AUC(空白)。

3. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为y轴，净AUC为x轴，绘制标准曲线。

4. 将样本的净AUC带入方程得到y值（μM），以微摩尔每升Trolox当量（TE）或每克样品的TE（μmol TE/ g或μmol TE/ L）表示HORAC值。

注意：若样本进一步稀释，则需要再乘以进一步稀释的稀释倍数n。

结果展示

典型标准曲线：

Figure 1. HORAC的标准曲线

示例：

取0.1 g植物组织加入1 mL 1×Assay Buffer进行匀浆研磨，取上清，之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：

样本的AUC为9.199，空白的AUC为1.937，净AUC=AUC(样本)-AUC(空白)=9.199-1.937=7.262，标准曲线为y=4.2835x-0.11，Trolox浓度为30.997 µM，HORAC值（样本）=30.997 µM=30.997 µM TE=30.997 µmol TE/L。