线粒体转氢酶-2（TH-2）活性检测试剂盒实验解决方案

原理

转氢酶（TH）位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互转化，调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2，催化NADPH和NAD+生成NADP+和NADH。CheKine 线粒体转氢酶-2（TH-2）活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织生物样本。在该试剂盒中，NADH和NADPH均在340 nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340 nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）替代NAD+，TH-2催化APAD+还原生成APADH，APADH在375 nm有特征光吸收，测定375 nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。

自备耗材

·酶标仪或紫外光分光光度计（能测375 nm处的吸光度）

·96孔UV板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管

·水浴锅、低温离心机

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃保存。

Working Reagent：临用前配制；将Reagent IV、V转移到Reagent III中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5 min；用不完的试剂分装后-20℃避光保存1个月，禁止反复冻融。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4 h内完成样品解冻。

1．组织中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：称取约0.1 g样本，加入1 mL ReagentⅠ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆；

2．600 g，4℃离心5 min。弃沉淀，将上清液移至另一离心管中；

3．11,000 g，4℃离心10 min，此步中上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-2（可选做）；

4．步骤3中沉淀即为线粒体，加入500 μL Reagent II，超声波破碎（冰浴，功率20％或200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30次），用于TH-2活性测定。

实验步骤

1.酶标仪或紫外光分光光度计预热30 min以上，调节波长到375 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。

2.操作表（下述操作在微量石英比色皿或96孔UV板中操作）：

3.混匀，立即记录375 nm处初始吸光值A1和10 min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.25可适当加大样本量。如果ΔA大于1.2，样本可用ReagentⅠ或Reagent II进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

TH-2活性的计算：

按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每g组织每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=149×ΔA÷W

V反总：反应总体积，2×10-4 L；ε：APADH摩尔消光系数，6.7×103 L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；V样：反应体系中加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入Reagent II体积，0.5 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10 min。