评价真菌引物覆盖度（1）选择数据库

最近一直在做真菌引物覆盖度评价的相关工作，踩了不少坑，特此将其中的内容记录下来。本文是该系列的第一篇，介绍一下引物评价前数据库的筛选。

目前真菌扩增子研究中用到的引物十分广泛，仅ITS区域就有几十种不同的引物对可供选择。一些常见的引物如下图所示:

Source: To ju,H.,et al., High-Coverage ITS Primers for the DNA-Based Identification of Ascomycetes and Basidiomycetes in Environmental Samples. Plos One,2012.7(7).

对于引物的评价首先要确定引物所在的区域，如评价ITS2则需要真菌ITS区域的序列作为数据库；评价ITS5、ITS1需要SSU区域的序列作为数据库；评价ITS4则需要LSU区域的序列作为数据库。我遇到的其中一个坑就是刚开始没注意这个问题，只用的ITS序列进行引物评价，发现很多引物覆盖度为。后来对照引物位置才发现这个问题。。。

UNITE数据库

ITS区域最常用的是Unite数据库，Unite官网为https://unite.ut.ee/，最新的版本更新于2017-12-1。它包含了多种类型的数据可供下载，如QIIME,Mothur,CREST,general Fasta release等。其中每种类型都包含了四种不同的序列，分别为：带s和不带s的两种；以及不带dev和带dev的两种。

带s表明该数据库包含singletons；不带s表明该数据库不包含singletons。有dev的是没有经过ITSx切除的，包含了部分LSU和SSU序列；而无dev的是经过ITSx切除的序列，只保留ITS部分。四种数据库可以根据需要自行选择。其中dev版本对ITS区域的引物覆盖度影响几乎为，我测试的结果是用dev版本的覆盖度大概能提高~0.001%。Unite数据库中序列和物种注释信息都在fasta文件里，方便我们进行覆盖度的计算。

QIIME release的四种数据库名称如下:

无s:

sh_general_release_dynamic_01.12.2017_dev.fasta

sh_general_release_dynamic_01.12.2017.fasta

有s:

sh_general_release_dynamic_s_01.12.2017.fasta

sh_general_release_dynamic_s_01.12.2017_dev.fasta

Silva数据库

对于LSU和SSU区域，常用的是Silva数据库，官网为https://www.arb-silva.de/。最近一次更新是在2017-12-13，最新版本为Silva 132。Silva也提供了QIIME的版本可供下载。

对于Silva数据库有几个需要注意的地方：第一，Silva数据库的序列和物种注释信息是分开的，因此在评价覆盖度之前需要将两者合并，才能计算不同分类水平上的覆盖度情况。

第二，这里还有一个坑是fasta文件中的序列是AGCU而不是AGCT，也需要我们提前将U转成T再进行blast。我又是一开始没注意这一点浪费了不少时间。在Silva_132_notes.txt的说明文件中提到了这一点：

clean_fasta.py (Primer Prospector) was called on the input SILVA_128_SSURef_tax_silva_full_align_trunc.fasta aligned file, with default parameters,to convert U characters to T characters, and remove gaps (the output is the initial_reads_SILVA132.fna file in the raw_data/ folder).

所以一定要认真看说明文档！！！

第三，SSU和LSU对物种注释分类水平的级别不一样。LSU能精确到种级别，而SSU只能到目级别。所以要想计算SSU区域引物科、属、种水平的覆盖度就没办法了。

第四，Silva数据库包含所有的真核生物信息，而我们评价真菌的覆盖度需要从中提取出所有的真菌序列，需要对数据库进行预处理。

下一篇介绍如何对Silva数据库在R中进行预处理，并合并序列和物种注释信息。

一个环境工程专业却做生信分析的深井冰博士，深受拖延症的困扰。想给自己一点压力，争取能够不定期分享学到的生信小技能，亦或看文献过程中的一些笔记与小收获，记录生活中的杂七杂八。